Các hệ thống dòng ngược hoạt động hiệu quả hơn trong việc tách các chất vì chúng sử dụng quá trình phân chia liên tục giữa hai pha lỏng, tạo ra nhiều giai đoạn cân bằng hoạt động như những tấm lý thuyết. Điều làm nên sự khác biệt của các hệ thống này so với các phương pháp pha rắn truyền thống là không có bất kỳ giá thể cố định nào tham gia vào quá trình. Điều này có nghĩa là chúng ta tránh được các vấn đề như các chất bám dính vĩnh viễn lên bề mặt hoặc thất thoát mẫu trong suốt quá trình. Thay vào đó, toàn bộ quá trình tách diễn ra một cách tự nhiên, dựa hoàn toàn vào sự phân bố khác nhau của các hợp chất giữa hai pha lỏng. Kết quả đạt được là khả năng phân biệt rõ ràng các phân tử rất giống nhau — ví dụ như các dẫn xuất taxane hoặc các dạng flavonoid khác nhau — vốn thường rất khó phân biệt bằng các phương pháp thông thường. Sắc ký dòng ngược (Counter Current Chromatography – CCC) thường đạt khoảng 3000 tấm lý thuyết, cao hơn nhiều so với sắc ký lỏng hiệu năng cao tiêu chuẩn (HPLC), vốn thường chỉ đạt tối đa khoảng 500 tấm lý thuyết. Vì sao điều này lại quan trọng đến vậy? Bởi vì khi các pha được làm mới liên tục và độ lan rộng của các dải chất giảm đi, chúng ta thu được các đỉnh sắc ký sắc nét hơn và các phân đoạn tinh khiết hơn. Đối với các nhà nghiên cứu đang nỗ lực chiết tách các thành phần hoạt tính từ các hỗn hợp phức tạp, độ chính xác vượt trội như vậy thực sự không thể thay thế được.
Phương pháp sắc ký pha lỏng đối lưu tốc độ cao (HSCCC) cho thấy những lợi thế rõ rệt khi tinh chế paclitaxel — một hợp chất chống ung thư không ổn định, đòi hỏi quy trình tách chiết cẩn trọng. Nghiên cứu chỉ ra rằng khoảng 98% paclitaxel nguyên vẹn có thể được thu hồi bằng các kỹ thuật HSCCC, vượt trội so với các phương pháp HPLC tiêu chuẩn chỉ đạt hiệu suất khoảng 82–85%, do các hợp chất này có xu hướng bám dính và phân hủy trên cột silica. Khi tách paclitaxel khỏi các chất tương tự như baccatin III và 10-deacetylbaccatin III, HSCCC đạt độ phân giải cao hơn khoảng 1,5 lần. Điều này chủ yếu xảy ra vì HSCCC hoạt động trong pha dung dịch thay vì dựa vào các tương tác bề mặt. Một ưu điểm lớn khác là lượng dung môi sử dụng giảm khoảng 60% so với quy trình HPLC truyền thống, giúp toàn bộ quá trình vận hành tiết kiệm chi phí hơn đáng kể. Đối với các phòng thí nghiệm xử lý các sản phẩm tự nhiên nhạy cảm, nơi việc giữ nguyên cấu trúc phân tử là ưu tiên hàng đầu, những kết quả này thực sự làm nổi bật lý do vì sao HSCCC được coi là lựa chọn ưu tiên.
Sắc ký dòng ngược giữ cho các phân tử sinh học nguyên vẹn vì phương pháp này loại bỏ hoàn toàn các giao diện pha rắn. Chính những giao diện này thường gây ra các vấn đề như biến tính, kết tụ và hiện tượng phân tử bị bám dính hoặc thất thoát. Các phương pháp truyền thống dựa vào các vật liệu như silica hoặc nhựa polymer có chứa các vị trí kỵ nước thực tế gây căng thẳng lên cấu trúc phân tử. Tuy nhiên, với quá trình phân chia lỏng–lỏng, các protein, kháng thể và peptide luôn duy trì ở dạng hòa tan trong suốt toàn bộ quy trình. Theo một nghiên cứu công bố trên tạp chí Nature năm ngoái, phương pháp này ngăn chặn hiện tượng mất cấu trúc không hồi phục—xảy ra ở khoảng 38% các protein điều trị khi sử dụng các phương pháp dựa trên pha rắn. Tỷ lệ thu hồi tăng từ 25% đến 40%, và quan trọng hơn cả là các enzyme vẫn giữ được hoạt tính và kháng thể tiếp tục duy trì khả năng liên kết với kháng nguyên. Điều làm nên giá trị đặc biệt của kỹ thuật này là nó không yêu cầu áp suất cao, không sử dụng vật liệu xốp dễ bị tắc nghẽn và tuyệt đối không phát sinh lực cắt gây phá hủy cấu trúc. Yếu tố này đặc biệt quan trọng đối với các sản phẩm sinh học nhạy cảm như kháng thể đơn dòng và nhiều loại hormone peptide—những phân tử vốn rất dễ bị tổn thương khi chịu tác động cơ học mạnh.
| Phương pháp tách | Nguy cơ biến tính | Mất do hấp phụ | Tính toàn vẹn cấu trúc |
|---|---|---|---|
| Pha rắn | Cao | 15–30% | Bị xâm phạm |
| Ngược dòng | Không đáng kể | <5% | Bảo quản |
Độ ổn định đóng vai trò rất quan trọng khi xử lý các phân tử sinh học nhạy cảm với nhiệt. Chỉ cần tiếp xúc ngắn với nhiệt độ khoảng 45 độ C cũng có thể gây ra những vấn đề nghiêm trọng như kết tụ không hồi phục trong các quy trình dựa trên cột, theo nghiên cứu được công bố trên Tạp chí Bioprocessing năm ngoái. Đó là lý do vì sao công nghệ CCC nổi bật, bởi nó hoạt động ở điều kiện áp suất và nhiệt độ phòng thông thường. Nhờ những ưu điểm này, nhiều phòng thí nghiệm đã bắt đầu chuyển sang các phương pháp ngược dòng để thực hiện các nhiệm vụ như tinh sạch kháng nguyên vắc-xin và nhiều ứng dụng trong y học tái tạo. Điều thực sự quan trọng ở đây không chỉ là lượng vật liệu thu hồi được mà còn là việc các phân tử đó có duy trì được chức năng sau quá trình xử lý hay không — yếu tố quyết định toàn bộ quy trình thành công hay thất bại.
Sắc ký dòng ngược (CCC) làm giảm lượng dung môi hữu cơ cần thiết khoảng 70% so với các phương pháp HPLC chuẩn bị truyền thống. Điều này đồng nghĩa với việc tiết kiệm thực sự không chỉ ở chi phí mua dung môi mà còn ở toàn bộ công việc bổ sung liên quan đến việc xử lý chúng cũng như quản lý chất thải nguy hại. Việc giảm tiêu thụ dung môi giúp hạ thấp chỉ số tác động môi trường (E Factor) — một thông số mà các nhà hóa học thường sử dụng — xuống còn khoảng 24 đối với các quy trình CCC; con số này tốt hơn nhiều so với dải giá trị thông thường từ 25 đến 100 của các kỹ thuật HPLC chuẩn bị tiêu chuẩn. Việc sử dụng ít dung môi hơn còn mang lại những lợi ích khác: thời gian chạy phân tích nhanh hơn, giảm tải cho hệ thống thiết bị và nói chung là loại bỏ hiệu quả những trở ngại gây khó khăn trong quá trình tinh chế, vốn thường làm chậm tiến độ công việc. Chẳng hạn, trong chiết xuất thực vật quy mô công nghiệp, lượng dung môi cần thiết thường là 10 lít khi áp dụng HPLC chuẩn bị, nhưng theo một số thử nghiệm gần đây được công bố trên Tạp chí Sắc ký – Phân tích So sánh, chỉ cần 3 lít dung môi khi sử dụng CCC. Toàn bộ những cải tiến này cho thấy CCC hoạt động hiệu quả ở quy mô lớn mà vẫn kiểm soát được chi phí, đồng thời vẫn thân thiện với môi trường. Và rõ ràng, cách tiếp cận như vậy hoàn toàn phù hợp với những yêu cầu ngày càng gia tăng của các cơ quan quản lý đối với các thực hành sản xuất xanh trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng.
Các hệ thống dòng ngược chiều giúp việc mở rộng quy mô từ các thử nghiệm phòng thí nghiệm nhỏ (ví dụ như các mẫu 1 mL hoặc 10 mL) lên đến các quy trình công nghiệp lớn (đôi khi lên tới 1.000 lít) trở nên khá đơn giản, gần như không cần điều chỉnh lại thông số nào. Điều kỳ diệu này xảy ra bởi vì phương pháp dựa trên các nguyên lý cơ bản của nhiệt động lực học phân bố, chứ không phụ thuộc vào các yếu tố như hình dạng cột, độ chặt của vật liệu nhồi, hay tốc độ dòng chảy ảnh hưởng đến quá trình truyền khối. Điều này có nghĩa trong thực tế là các nhà nghiên cứu có thể sử dụng cùng một loại dung môi và cùng tỷ lệ dòng chảy bất kể họ đang làm việc với thiết bị quy mô nhỏ hay quy mô rất lớn. Nhiều phòng thí nghiệm thậm chí còn áp dụng trực tiếp phương pháp đã phát triển trên thiết bị 1 lít sang thiết bị 1.000 lít mà không thay đổi bất kỳ thông số nào liên quan đến tỷ lệ pha, tốc độ quay hoặc các đường cong gradient — những yếu tố thường gây nhiều bận tâm cho người vận hành. Loại tính nhất quán này giúp các công ty tiết kiệm khoảng một nửa thời gian thường dành cho việc xác lập tính hiệu lực (validation) quy trình và tránh được những vòng phát triển lại tốn kém. Đối với những người sản xuất các loại thuốc sinh học phức tạp, vắc-xin hoặc thậm chí các dược phẩm chiết xuất từ thực vật, khả năng mở rộng nhanh chóng này đồng nghĩa với việc đưa sản phẩm đến tay bệnh nhân sớm hơn, đồng thời giảm thiểu rủi ro trong quá trình thương mại hóa. Chính vì vậy, sắc ký dòng ngược chiều đã trở thành một công cụ vô cùng quan trọng đối với bất kỳ ai nghiêm túc theo đuổi các kỹ thuật tinh sạch sinh học hiện đại.
Sắc ký dòng ngược (CCC) là một quá trình tách pha lỏng–lỏng không sử dụng pha tĩnh, nhờ đó tránh được các vấn đề như hấp phụ không hồi phục và thất thoát mẫu thường gặp trong các phương pháp sử dụng chất mang rắn.
CCC đạt tới 3000 đĩa lý thuyết, vượt xa mức trung bình 500 đĩa của HPLC tiêu chuẩn, từ đó mang lại độ phân giải cao hơn và hiệu quả tách tinh khiết hơn.
CCC sử dụng ít dung môi hữu cơ hơn tới 70% so với HPLC chuẩn bị (prep-HPLC), giúp giảm chi phí vận hành và tác động môi trường thông qua việc hạ thấp hệ số E (E-Factor).
CCC tránh được hiện tượng biến tính và thất thoát do hấp phụ bằng cách loại bỏ hoàn toàn chất mang rắn, nhờ đó bảo toàn tính toàn vẹn của phân tử sinh học và nâng cao tỷ lệ thu hồi.
Có, CCC có thể mở rộng quy mô từ các mẫu phòng thí nghiệm nhỏ đến các mẻ sản xuất công nghiệp lớn với mức tối ưu lại tối thiểu, do đó rất phù hợp cho sản xuất dược phẩm và vắc-xin.
EN
