Els sistemes de contracorrent funcionen millor per a la separació de substàncies perquè utilitzen una partició líquid-líquid contínua, que crea múltiples etapes d’equilibri que actuen com a plaques teòriques. El que fa especials aquests sistemes en comparació amb els mètodes tradicionals de fase sòlida és l’absència de suports estacionaris. Això vol dir que no tenim problemes amb l’adsorció irreversible de substàncies sobre les superfícies ni amb la pèrdua de mostres durant el procés. En lloc d’això, tota la separació es produeix de forma natural, basada únicament en la manera com es distribueixen diferents compostos entre els líquids. El resultat? Podem distingir molècules molt semblants, com ara taxans o diverses formes de flavonoides, que altrament seria difícil diferenciar. La cromatografia de contracorrent (CCC) sol assolir uns 3000 plaques teòriques, molt més del que sol aconseguir la cromatografia líquida d’alta resolució (HPLC) en condicions habituals, la qual normalment no supera les 500 plaques com a màxim. Per què és tan important això? Perquè, quan les fases es renoven contínuament i hi ha menys dispersió de les bandes de substàncies, obtenim pics molt més estrets i fraccions més pures. I per als investigadors que intenten extreure principis actius de barreges complexes, aquest nivell de precisió és insuperable.
El mètode de cromatografia de contracorrent d’alta velocitat (HSCCC) mostra clars avantatges en la purificació del paclitaxel, un compost anticancerígen inestable que requereix una isolació cuidadosa. La recerca indica que es pot recuperar aproximadament el 98 % del paclitaxel íntegre mitjançant tècniques HSCCC, cosa que supera els mètodes estàndard d’HPLC, que només aconsegueixen un 82–85 %, ja que els compostos tendeixen a adherir-se i degradar-se en columnes de sílice. En quant a la separació del paclitaxel de substàncies similars, com la baccatina III i la 10-desacetilbaccatina III, l’HSCCC assolix una resolució aproximadament 1,5 vegades millor. Això es deu principalment al fet que l’HSCCC treballa en fase líquida, en lloc de basar-se en interaccions superficials. Un altre avantatge important és que l’ús de dissolvents es redueix aproximadament un 60 % respecte als processos tradicionals d’HPLC, el que fa que tota l’operació sigui molt més rendible. Per als laboratoris que treballen amb productes naturals delicats, on és fonamental mantenir intacta l’estructura dels compostos, aquests resultats posen realment de manifest per què l’HSCCC destaca com a mètode preferit.
La cromatografia en contracorrent manté les biomolècules intactes perquè elimina completament aquelles interfícies de fase sòlida. Aquestes interfícies són habitualment les responsables de problemes com la desnaturalització, l’agregació i la retenció i pèrdua de molècules. Els mètodes tradicionals es basen en materials com la sílice o resines polimèriques que contenen aquests punts hidrofòbics, els quals, de fet, provoquen tensions que alteren la conformació de les molècules. En canvi, amb la partició líquid-líquid, les proteïnes, els anticossos i els pèptids romanen tot el temps en solució durant tot el procés. Segons una recerca publicada a la revista Nature l’any passat, aquest enfocament evita el problema del desplegament irreversible que es produeix en aproximadament el 38 % de les proteïnes terapèutiques quan es fan servir mètodes de fase sòlida. Els percentatges de recuperació augmenten entre un 25 % i un 40 %, i, cosa important, les enzimes conserven la seva activitat i els anticossos mantenen la seva capacitat de lligar antígens. El que fa tan valuosa aquesta tècnica és l’absència de pressions elevades, l’absència de materials porosos que puguin obturar-se i, sobretot, l’absència de forces de tall que puguin desintegrar les molècules. Això és especialment rellevant per a productes biològics sensibles, com ara els anticossos monoclonals i diverses hormones peptídiques, que suporten molt malament els tractaments agressius.
| Mètode de separació | Risc de desnaturalització | Pèrdua per adsorció | Integritat estructural |
|---|---|---|---|
| Fase sòlida | Alta | 15–30% | Compromès |
| Contracorrent | Insignificant | <5% | Conservat |
L'estabilitat és molt important quan es treballa amb biomolècules sensibles a la calor. Només un breu contacte amb temperatures d'aproximadament 45 °C pot causar problemes greus, com ara l'agregació irreversible en processos basats en columnes, segons una recerca publicada l'any passat al Journal of Bioprocessing. Per això, la tecnologia CCC destaca, ja que funciona a pressió i temperatura ambient normals. A causa d'aquests avantatges, molts laboratoris han començat a passar als mètodes de contracorrent per a aplicacions com la purificació d'antígens vacunals i diverses aplicacions en medicina regenerativa. El que realment compta aquí no és només la quantitat de material recuperat, sinó si les molècules romanen funcionals després del procés, fet que determina si tota l'operació ha tingut èxit o no.
La cromatografia en contracorrent redueix l'ús de solvents orgànics en un 70 % aproximadament en comparació amb els mètodes tradicionals de HPLC preparativa. Això significa estalviar diners reals, no només en la compra de solvents, sinó també en tota la feina addicional implicada en la seva manipulació i en la gestió de residus perillosos. La reducció de l'ús de solvents fa baixar el que els químics anomenen factor ambiental o E Factor fins a uns 24 per als processos de CCC, una millora significativa respecte a la gamma habitual de 25 a 100 observada amb les tècniques estàndard de HPLC preparativa. L'ús reduït de solvents té altres avantatges: accelera les proves, exerceix menys tensió sobre els sistemes d'equipament i, en general, suavitza aquells irritants obstacles de purificació que ralentitzen els processos. Preneu com a exemple l'extracció botànica a escala industrial: segons algunes proves recents publicades al Journal of Chromatography Comparative Analysis, allò que normalment requeria 10 litres de solvent amb HPLC preparativa es pot fer amb només 3 litres mitjançant CCC. Totes aquestes millores fan que la CCC funcioni bé a grans escales sense suposar un cost excessiu, alhora que continua sent respectuosa amb el medi ambient. I reconeguem-ho: aquest tipus d'enfocament s'ajusta perfectament a allò que actualment demanen els reguladors en les pràctiques de fabricació verda als sectors farmacèutic i nutracèutic.
Els sistemes de corrent contrari fan que l’escalar des de petites proves de laboratori (com ara mostres de 1 mL o 10 mL) fins a grans operacions industrials (de vegades fins a 1.000 litres) sigui prou senzill, amb gairebé cap necessitat de tornar a ajustar res. La clau d’aquesta facilitat rau en el fet que es basen en la termodinàmica bàsica de la partició, i no en factors com la forma de la columna, la densitat d’empaquetament o les velocitats de flux que afecten la transferència de massa. En la pràctica, això significa que els investigadors poden utilitzar els mateixos dissolvents i les mateixes proporcions de flux independentment de si treballen amb equips petits o molt grans. Molts laboratoris traslladen directament els seus mètodes d’un sistema d’1 litre a un de 1.000 litres sense modificar res respecte als percentatges de fases, les velocitats de rotació ni els perfils de gradient pels quals tothom sol estar tan preocupat. Aquest tipus de coherència estalvia a les empreses aproximadament la meitat del temps que normalment dedicarien a la validació de processos i evita costoses rondes de redisseny. Per a professionals que desenvolupen fàrmacs biològics complexos, vacunes o fins i tot medicaments d’origen vegetal, aquesta capacitat d’escalar ràpidament implica poder posar els productes a disposició dels pacients més aviat i reduir els riscos associats a la seva introducció al mercat. És per això que la cromatografia de corrent contrari s’ha convertit en una eina tan important per a qualsevol persona que prengui seriosament les tècniques modernes de biorpurificació.
La cromatografia en contracorrent (CCC) és un procés de separació líquid-líquid sense fase estacionària, el qual evita problemes com l'adsorció irreversible i la pèrdua de mostra que es donen en els mètodes amb suport sòlid.
La CCC assolix fins a 3000 plaques teòriques, superant les 500 plaques mitjanes de la CCLP estàndard, cosa que comporta una major resolució i separacions més pures.
La CCC utilitza fins a un 70 % menys de solvents orgànics que la CCLP preparativa, reduint els costos operatius i l'impacte ambiental mitjançant la disminució de l'E-Factor.
La CCC evita la desnaturalització i la pèrdua per adsorció eliminant els suports sòlids, preservant la integritat de les biomolècules i millorant les taxes de recuperació.
Sí, la CCC pot escalar des de mostres petites de laboratori fins a lots industrials grans amb una reoptimització mínima, cosa que la fa ideal per a la producció de fàrmacs i vacunes.
EN
