Системи протиточного розділення працюють ефективніше при розділенні речовин, оскільки вони використовують безперервне рідино-рідинне розподілення, що створює кілька стадій рівноваги, подібних до теоретичних тарілок. Те, що робить ці системи особливими порівняно з традиційними методами на твердій фазі, — це відсутність нерухомих носіїв. Це означає, що ми не стикаємося з проблемами незворотного прилипання речовин до поверхонь чи втрати зразків під час процесу. Натомість усе розділяється природним чином виключно на основі того, як різні сполуки розподіляються між рідинами. Результат? Ми можемо надійно розрізняти дуже схожі молекули, наприклад таксані або різні форми флавоноїдів, які інакше важко відрізнити одне від одного. Протиточна хроматографія (ПТХ) зазвичай забезпечує близько 3000 теоретичних тарілок — значно більше, ніж стандартна ВЕРХ, яка в більшості випадків досягає максимум 500 тарілок. Чому це так важливо? Тому що, коли фази постійно оновлюються й розмивання смуг речовин зменшується, ми отримуємо набагато гостріші піки та чистіші фракції. А для дослідників, які намагаються виділити активні компоненти зі складних сумішей, така точність просто не має собі рівних.
Метод високошвидкісної протиточній хроматографії (ВШПХХ) демонструє чіткі переваги під час очищення паклітакселу — нестабільної протипухлинної сполуки, яку потрібно обережно ізолювати. Дослідження показують, що за допомогою методів ВШПХХ можна відновити близько 98 % незміненого паклітакселу, що перевершує стандартні методи ВРРХ, які забезпечують лише 82–85 % відновлення, оскільки сполуки мають тенденцію адсорбуватися й розкладатися на кремнієвих колонках. Щодо розділення паклітакселу від подібних речовин, таких як баккатин III та 10-деацетилбаккатин III, ВШПХХ забезпечує приблизно в 1,5 раза кращу роздільну здатність. Це відбувається переважно тому, що ВШПХХ працює в розчинній фазі, а не ґрунтується на поверхневих взаємодіях. Ще однією значною перевагою є скорочення витрат розчинників приблизно на 60 % порівняно з традиційними процесами ВРРХ, що робить увесь процес набагато економічнішим. Для лабораторій, що працюють із делікатними природними продуктами, де найважливіше зберегти цілісність структури, ці результати справді підкреслюють, чому ВШПХХ вважається переважним варіантом.
Хроматографія з протитоком зберігає біломолекули незмінними, оскільки повністю усуває твердофазні інтерфейси. Саме ці інтерфейси зазвичай викликають такі проблеми, як денатурація, агрегація та адсорбція молекул із їх подальшою втратою. Традиційні методи ґрунтуються на таких матеріалах, як кремнезем або полімерні смоли, що містять гідрофобні ділянки, які фактично спричиняють деформацію просторової структури молекул. Натомість при розділенні за принципом рідина–рідина білки, антитіла та пептиди залишаються в розчині протягом усього процесу. Згідно з дослідженням, опублікованим минулого року в журналі Nature, цей підхід запобігає необоротному розгортанню, яке виникає приблизно у 38 % терапевтичних білків під час використання твердофазних методів. Коефіцієнти відновлення зростають на 25–40 %, а що особливо важливо — ферменти зберігають свою каталітичну активність, а антитіла — здатність до специфічного зв’язування з антигенами. Цей метод є надзвичайно цінним завдяки відсутності високого тиску, пористих матеріалів, що можуть забиватися, а також будь-яких сил зсуву, які руйнують чутливі структури. Це має особливе значення для чутливих біологічних препаратів, таких як моноклональні антитіла та різні пептидні гормони, які дуже погано переносять механічне навантаження.
| Метод розділення | Ризик денатурації | Адсорбційні втрати | Структурна цілісність |
|---|---|---|---|
| Твердофазний | Високих | 15–30% | Порушено |
| Протиточний | Незначне | <5% | Зберігається |
Стабільність має велике значення під час роботи з термолабільними біомолекулами. Навіть короткочасний контакт із температурами близько 45 °C може призвести до серйозних проблем, таких як незворотна агрегація у процесах, що використовують хроматографічні колонки, — згідно з дослідженням, опублікованим минулого року в Journal of Bioprocessing. Саме тому технологія CCC вирізняється тим, що працює за звичайних умов кімнатного тиску й температури. Завдяки цим перевагам багато лабораторій почали переходити на протиточні методи для таких завдань, як очищення антигенів вакцин та різних застосувань у регенеративній медицині. Тут справжнє значення має не лише кількість відновленого матеріалу, а й те, чи зберігають молекули свою функціональність після обробки — саме це визначає, чи вдалася вся операція чи ні.
Хроматографія з протитоком скорочує потребу в органічних розчинниках приблизно на 70 % порівняно з традиційними методами підготовчої ВЕРХ-хроматографії. Це означає реальну економію коштів не лише на закупівлі розчинників, а й на всій додатковій роботі, пов’язаній із їх обробкою, а також утилізацією небезпечних відходів. Зниження використання розчинників зменшує так званий екологічний коефіцієнт (E Factor), який хіміки використовують для оцінки впливу процесу на навколишнє середовище, до приблизно 24 для процесів хроматографії з протитоком. Це значно кращий показник, ніж звичайний діапазон 25–100, характерний для стандартних методів підготовчої ВЕРХ-хроматографії. Зниження використання розчинників має й інші переваги: прискорює хроматографічні аналізи, зменшує навантаження на обладнання та загалом полегшує подолання тих неприємних перешкод у процесі очищення, які уповільнюють роботу. Наприклад, у промисловому масштабі екстракції ботанічних матеріалів те, що зазвичай вимагає 10 літрів розчинника за методом підготовчої ВЕРХ-хроматографії, можна здійснити лише за 3 літри розчинника за допомогою хроматографії з протитоком — згідно з деякими недавніми даними, наведеними в журналі «Journal of Chromatography Comparative Analysis». Усі ці покращення означають, що хроматографія з протитоком добре працює в більших масштабах без надмірних фінансових витрат і водночас є екологічно безпечнішою. І, чесно кажучи, саме такий підхід відповідає сучасним вимогам регуляторних органів щодо «зелених» виробничих практик у фармацевтичній та нутрицевтичній галузях.
Системи протиточного розділення дозволяють досить просто масштабувати процес від невеликих лабораторних досліджень (наприклад, зразків об’ємом 1 мл або 10 мл) до великих промислових виробництв (іноді до 1000 літрів), майже не потребуючи повторної настройки параметрів. Це «чарівне» спрощення стає можливим завдяки тому, що процес ґрунтується на базових термодинамічних принципах розподілу, а не на таких факторах, як форма колонки, ступінь ущільнення фаз або швидкість потоку, що впливають на перенесення маси. На практиці це означає, що дослідники можуть використовувати однакові розчинники й співвідношення потоків незалежно від того, чи працюють вони з мікромасштабним чи великим обладнанням. Багато лабораторій навіть безпосередньо переносять свої методики з установки об’ємом 1 літр на установку об’ємом 1000 літрів, не змінюючи співвідношення фаз, швидкості обертання чи профілів градієнтів, які так часто викликають занепокоєння. Така узгодженість економить компаніям приблизно половину часу, який зазвичай витрачається на валідацію процесів, і уникнути дорогостоячих етапів повторного розроблення. Для спеціалістів, що виробляють складні біологічні лікарські засоби, вакцини чи навіть рослинні препарати, здатність швидко масштабувати процес означає швидше доставляти продукти пацієнтам та зменшувати ризики під час виведення їх на ринок. Саме тому хроматографія з протиточним розділенням стала надзвичайно важливим інструментом для всіх, хто серйозно займається сучасними методами біопуріфікації.
Протиточна хроматографія (ПТХ) — це процес розділення рідина–рідина без нерухомої фази, що усуває такі проблеми, як необоротна адсорбція та втрата зразків, характерні для методів із твердою носієвою фазою.
ПТХ забезпечує до 3000 теоретичних тарілок, перевершуючи середні 500 тарілок стандартної ВРР-ХРЛГ, що призводить до вищої роздільної здатності та чистіших розділень.
ПТХ використовує на 70 % менше органічних розчинників, ніж підготовча ВРР-ХРЛГ, що знижує експлуатаційні витрати та навантаження на навколишнє середовище за рахунок зменшення коефіцієнта E-Factor.
ПТХ усуває денатурацію та адсорбційні втрати шляхом відмови від твердих носіїв, зберігаючи структурну цілісність біомолекул і підвищуючи коефіцієнт виходу.
Так, ПТХ може масштабуватися від малих лабораторних зразків до великих промислових партій із мінімальним повторним оптимізуванням, що робить її ідеальною для виробництва лікарських засобів та вакцин.
EN
