Системы противоточного разделения работают лучше при разделении веществ, поскольку они используют непрерывное жидкостно-жидкостное распределение, создающее несколько ступеней равновесия, действующих подобно теоретическим тарелкам. Особенность этих систем по сравнению с традиционными методами на твёрдой фазе заключается в отсутствии неподвижных опорных материалов. Это означает, что мы не сталкиваемся с проблемами необратимого адсорбирования веществ на поверхностях или потери проб в ходе процесса. Вместо этого всё разделение происходит естественным образом исключительно на основе различий в распределении соединений между жидкими фазами. Результат? Мы можем надёжно разделять очень близкие по структуре молекулы — например, таксаны или различные формы флавоноидов, которые иначе трудно различить. Противоточная хроматография (ПТХ) обычно обеспечивает около 3000 теоретических тарелок — значительно больше, чем стандартная ВЭЖХ, которая в большинстве случаев достигает максимум 500 тарелок. Почему это имеет такое большое значение? Потому что при постоянном обновлении фаз и меньшем растекании зон анализируемых веществ получаются гораздо более острые пики и более чистые фракции. А для исследователей, стремящихся выделить активные компоненты из сложных смесей, такая точность просто не имеет себе равных.
Метод высокоэффективной противоточной хроматографии (ВЭПХХ) демонстрирует очевидные преимущества при очистке паклитаксела — нестабильного противоопухолевого соединения, требующего аккуратного выделения. Исследования показывают, что с помощью методов ВЭПХХ можно восстановить около 98 % неразрушенного паклитаксела, что превосходит стандартные методы ВЭЖХ, позволяющие получить лишь около 82–85 %, поскольку соединения склонны адсорбироваться и разлагаться на кремнезёмных колонках. При разделении паклитаксела от близких по структуре веществ, таких как баккатин III и 10-деацетилбаккатин III, ВЭПХХ обеспечивает примерно в 1,5 раза более высокое разрешение. Это объясняется в первую очередь тем, что ВЭПХХ осуществляется в жидкой фазе, а не за счёт взаимодействий на поверхности. Ещё одним важным преимуществом является снижение расхода растворителей примерно на 60 % по сравнению с традиционными процессами ВЭЖХ, что делает весь процесс значительно более экономически эффективным. Для лабораторий, работающих с деликатными природными продуктами, где сохранение структурной целостности соединений имеет первостепенное значение, эти результаты наглядно подчёркивают, почему ВЭПХХ выделяется как предпочтительный метод.
Хроматография противоточного распределения сохраняет биомолекулы в неизменном виде, поскольку полностью исключает твёрдые фазовые интерфейсы. Именно эти интерфейсы обычно вызывают такие проблемы, как денатурация, агрегация и адсорбция молекул с последующей их потерей. Традиционные методы основаны на использовании таких материалов, как кремнезём или полимерные смолы, обладающих гидрофобными участками, которые фактически нарушают пространственную структуру молекул. В отличие от этого, при жидкостно-жидкостном распределении белки, антитела и пептиды остаются в растворе на протяжении всего процесса. Согласно исследованию, опубликованному в журнале Nature в прошлом году, данный подход предотвращает необратимое разворачивание, которое наблюдается примерно у 38 % терапевтических белков при использовании твёрдых фаз. Показатели выхода увеличиваются на 25–40 %, а что особенно важно — ферменты сохраняют свою каталитическую активность, а антитела — способность связываться с антигенами. Ценность этой методики заключается в отсутствии высокого давления, пористых материалов, способных забиваться, а также в полном отсутствии сил сдвига, разрушающих молекулы. Это имеет решающее значение для чувствительных биологических препаратов, таких как моноклональные антитела и различные пептидные гормоны, которые крайне плохо переносят механические воздействия.
| Метод разделения | Риск денатурации | Адсорбционные потери | Структурная целостность |
|---|---|---|---|
| Твёрдая фаза | Высокий | 15–30% | Нарушена целостность |
| Противоточный | Незначительный | <5% | Сохраняется |
Стабильность имеет решающее значение при работе с термолабильными биомолекулами. Даже кратковременный контакт с температурами около 45 °C может вызвать серьёзные проблемы, такие как необратимая агрегация в колоночных процессах, согласно исследованию, опубликованному в прошлом году в Journal of Bioprocessing. Именно поэтому технология непрерывного противоточного распределения (CCC) выделяется среди других: она работает при нормальных атмосферном давлении и комнатной температуре. Благодаря этим преимуществам многие лаборатории начали переходить на противоточные методы для таких задач, как очистка антигенов вакцин и различных применений в регенеративной медицине. Здесь важна не только величина выхода целевого материала, но и сохранение функциональности молекул после обработки — именно это определяет, была ли вся операция успешной или нет.
Хроматография противоточного разделения сокращает потребность в органических растворителях примерно на 70 % по сравнению с традиционными методами подготовительной ВЭЖХ. Это означает реальную экономию средств — не только на закупке растворителей, но и на всех дополнительных операциях, связанных с их обращением, а также на утилизации опасных отходов. Снижение расхода растворителей приводит к уменьшению так называемого экологического коэффициента (E-Factor) до примерно 24 для процессов хроматографии противоточного разделения (CCC). Это значительно лучше, чем обычный диапазон значений от 25 до 100, характерный для стандартных методов подготовительной ВЭЖХ. Снижение расхода растворителей даёт и другие преимущества: ускоряет анализы, снижает нагрузку на оборудование и в целом помогает преодолевать неприятные «узкие места» при очистке, замедляющие процессы. Например, в промышленном масштабе при экстракции растительного сырья объём растворителя, необходимый для подготовительной ВЭЖХ (обычно 10 литров), может быть сокращён до всего 3 литров при использовании CCC — согласно некоторым недавним испытаниям, опубликованным в журнале «Journal of Chromatography Comparative Analysis». Все эти улучшения означают, что CCC эффективно работает в крупномасштабных производствах без чрезмерных затрат и одновременно остаётся экологически безопасной технологией. И, честно говоря, такой подход полностью соответствует современным требованиям регуляторных органов к «зелёным» производственным практикам в фармацевтической и нутрицевтической отраслях.
Системы противоточного разделения позволяют масштабировать процессы от небольших лабораторных испытаний (например, образцов объёмом 1 мл или 10 мл) до крупномасштабных промышленных операций (иногда до 1000 литров) достаточно просто — практически без необходимости повторной настройки параметров. Этот эффект достигается благодаря тому, что принцип работы основан на фундаментальной термодинамике распределения, а не на таких факторах, как форма колонки, степень уплотнения наполнителя или скорость потока, влияющая на массопередачу. На практике это означает, что исследователи могут использовать одни и те же растворители и соотношения потоков независимо от того, работают ли они с миниатюрным или гигантским оборудованием. Многие лаборатории фактически переносят свои методики напрямую с установки объёмом 1 литр на установку объёмом 1000 литров, не изменяя соотношения фаз, скорости вращения или профилей градиента — тех параметров, которым обычно уделяется столь пристальное внимание. Такая согласованность позволяет компаниям сократить примерно вдвое время, затрачиваемое на валидацию процессов, и избежать дорогостоящих циклов повторной разработки. Для специалистов, производящих сложные биологические препараты, вакцины или даже растительные лекарственные средства, возможность быстрого масштабирования означает более оперативное поступление продукции к пациентам и снижение рисков при выходе на рынок. Именно поэтому противоточная хроматография стала столь важным инструментом для всех, кто серьёзно занимается современными методами биопурификации.
Противоточная хроматография (ПТХ) — это процесс жидкостно-жидкостного разделения без неподвижной фазы, что позволяет избежать таких проблем, как необратимая адсорбция и потери образца, характерных для методов с твёрдым носителем.
ПТХ обеспечивает до 3000 теоретических тарелок, превосходя средние 500 тарелок стандартной ВЭЖХ и обеспечивая более высокое разрешение и более чистое разделение.
ПТХ использует на 70 % меньше органических растворителей по сравнению с препаративной ВЭЖХ, что снижает эксплуатационные расходы и воздействие на окружающую среду за счёт уменьшения показателя E-Factor.
ПТХ предотвращает денатурацию и адсорбционные потери за счёт исключения твёрдых носителей, сохраняя структурную целостность биомолекул и повышая выход очищенных продуктов.
Да, ПТХ масштабируется от небольших лабораторных проб до крупных промышленных партий при минимальной необходимости повторной оптимизации, что делает её идеальным решением для производства лекарственных средств и вакцин.
EN
