Os sistemas en contracorrente funcionan mellor na separación de substancias porque utilizan unha partición líquido-líquido continua, o que crea múltiples etapas de equilibrio que actúan como pratos teóricos. O que fai que estes sistemas sexan especiais comparados cos métodos tradicionais en fase sólida é que non implican soportes estacionarios. Isto significa que non temos problemas coa adhesión irreversible de substancias ás superficies nin coa perda de mostras durante o proceso. En troques, todo se separa de maneira natural baseándose puramente na forma en que os distintos compostos se distribúen entre os líquidos. ¿Cal é o resultado? Podemos distinguir moléculas moi semellantes, como os taxanos ou as diversas formas de flavonoides, que doutro modo resultarían difíciles de diferenciar. A Cromatografía en Contracorrente (CCC) alcanza normalmente uns 3000 pratos teóricos, moito máis do que a HPLC estándar logra na maioría dos casos, a cal xeralmente non supera os 500 pratos. ¿Por que ten tanta importancia isto? Porque cando as fases se renoven continuamente e hai menos dispersión das bandas de substancias, obtemos picos moito máis nítidos e fraccións máis puras. E para os investigadores que intentan extraer principios activos de mesturas complexas, este tipo de precisión simplemente non ten rival.
O método de Cromatografía de Contracorrente de Alta Velocidade (HSCCC) mostra claros beneficios ao purificar o paclitaxel, un composto anticancro inestable que require un illamento cuidadoso. As investigacións indican que se pode recuperar arredor do 98 % do paclitaxel íntegro mediante técnicas HSCCC, o que supera os métodos estándar de HPLC, que só conseguen unha recuperación de aproximadamente o 82 ao 85 %, xa que os compostos tenden a adherirse e descompoñerse nas columnas de sílice. Ao separar o paclitaxel de substancias similares, como a baccatina III e a 10-desacetilbaccatina III, a HSCCC alcanza unha resolución aproximadamente 1,5 veces mellor. Isto ocorre principalmente porque a HSCCC opera en fase líquida, en vez de basearse en interaccións superficiais. Outra gran vantaxe é que o consumo de disolventes redúcese arredor dun 60 % en comparación cos procesos tradicionais de HPLC, o que fai que toda a operación sexa moito máis rentable. Para os laboratorios que traballan con produtos naturais delicados, nos que o máis importante é manter a estrutura íntegra, estes resultados ponen realmente en valor por que a HSCCC se destaca como a opción preferida.
A cromatografía en contracorrente mantén as biomoléculas intactas porque elimina por completo esas interfaces de fase sólida. Estas interfaces son as que normalmente causan problemas como desnaturalización, agregación e atrapamento e perda das moléculas. Os métodos tradicionais dependen de materiais como a sílice ou resinas poliméricas que presentan eses puntos hidrofóbicos que, de feito, provocan tensión nas conformacións moleculares. Pero co fraccionamento líquido-líquido, as proteínas, os anticorpos e os péptidos permanecen en solución durante todo o proceso. Segundo unha investigación publicada na revista Nature o ano pasado, esta aproximación evita o problema de despregamento irreversible que ocorre no 38 % das proteínas terapéuticas cando se empregan métodos de fase sólida. As taxas de recuperación aumentan entre un 25 % e un 40 %, e, o que é máis importante, as enzimas conservan a súa actividade e os anticorpos manteñen a súa capacidade de unirse a antíxenos. O que fai tan valiosa esta técnica é que non require alta presión, non emprega materiais porosos que poidan obstruírse e, definitivamente, non xera forzas de cizallamento que danen as moléculas. Isto resulta moi relevante para produtos biolóxicos sensibles, como os anticorpos monoclonais e varias hormonas peptídicas, que non soportan ben o manexo brusco.
| Método de separación | Risco de desnaturalización | Perda adsorptiva | Integridade estrutural |
|---|---|---|---|
| Fase sólida | Alta | 15–30% | Comprometido |
| Contra-corrente | Desprezable | <5% | Conservado |
A estabilidade é moi importante ao traballar con biomoléculas sensibles ao calor. Incluso un breve contacto con temperaturas arredor dos 45 graos Celsius pode causar problemas graves, como a agregación irreversible en procesos baseados en columnas, segundo unha investigación publicada o ano pasado na revista Journal of Bioprocessing. É por iso que a tecnoloxía CCC se destaca, xa que funciona a presión e temperatura ambiente normais. Debido a estas vantaxes, moitos laboratorios comezaron a pasar aos métodos de contra-corrente para aplicacións como a purificación de antíxenos vacinais e diversas aplicacións na medicina rexenerativa. O que realmente importa aquí non é só a cantidade de material recuperado, senón se esas moléculas conservan a súa funcionalidade despois do procesamento, o que determina se toda a operación foi exitosa ou non.
A cromatografía en contracorrente reduce a cantidade de disolventes orgánicos necesarios en aproximadamente un 70 % en comparación cos métodos tradicionais de HPLC preparativa. Isto significa un aforro real non só na compra de disolventes, senón tamén en todo o traballo adicional implicado na súa manipulación e na xestión de residuos perigosos. A redución no consumo de disolventes fai baixar o que os químicos denominan «factor ambiental» ou «E Factor» ata uns 24 para os procesos de CCC, un valor moi mellor que a gama habitual de 25 a 100 observada nas técnicas estándar de HPLC preparativa. O uso reducido de disolventes ten outras vantaxes: acelera as análises, reduce a sobrecarga nos sistemas de equipos e, en xeral, elimina eses incómodos obstáculos na purificación que ralentizan os procesos. Tome como exemplo a extracción botánica á escala industrial: segundo algunhas probas recentes publicadas no Journal of Chromatography Comparative Analysis, o que normalmente requiriría 10 litros de disolvente con HPLC preparativa pode realizarse con tan só 3 litros empregando CCC. Todas estas melloras fan que a CCC funcione ben á escala maior sen supor un custo excesivo, ao tempo que resulta beneficioso para o medio ambiente. E, francamente, este tipo de enfoque encaixa perfectamente co que os reguladores buscan hoxe en día nas prácticas de fabricación ecolóxica nos sectores farmacéutico e nutracéutico.
Os sistemas en contracorrente fan que a escalada desde pequenas probas de laboratorio (como esas mostras de 1 mL ou 10 mL) ata grandes operacións industriais (ás veces de até 1.000 litros) sexa bastante directa, con case ningunha necesidade de axustar novamente os parámetros. A «máxica» prodúcese porque se basea na termodinámica básica da partición, e non en factores como a forma da columna, o grao de compactación dos materiais ou as velocidades de fluxo que afectan á transferencia de masa. O que isto significa na práctica é que os investigadores poden empregar os mesmos disolventes e as mesmas proporcións de fluxo independentemente de que estean traballando con equipos pequenos ou masivos. Moitos laboratorios trasladan, de feito, os seus métodos directamente dunha instalación de 1 litro a outra de 1.000 litros sen modificar nada das proporcións de fases, das velocidades de rotación nin dos perfís de gradiente sobre os que todos se preocupan tanto. Este tipo de coherencia aforra ás empresas aproximadamente a metade do tempo que normalmente se dedicaría á validación dos procesos e evita caras rondas de redezenvolvemento. Para quen fabrica fármacos biolóxicos complexos, vacinas ou incluso medicamentos de orixe vexetal, esta capacidade de escalar rapidamente significa levar os produtos aos pacientes máis rápido e reducir os riscos asociados á súa comercialización. É por iso que a cromatografía en contracorrente converteuse nunha ferramenta tan importante para calquera persoa que leve en serio as técnicas modernas de biorpurificación.
A Cromatografía en Corrente Contraria (CCC) é un proceso de separación líquido-líquido sen fase estacionaria, o que evita problemas como a adsorción irreversible e a perda de mostra observados nos métodos con soporte sólido.
A CCC alcanza ata 3000 pratos teóricos, superando os 500 pratos medios da HPLC estándar, o que resulta nunha maior resolución e separacións máis puras.
A CCC utiliza ata un 70 % menos de disolventes orgánicos que a HPLC preparativa, reducindo os custos operativos e o impacto ambiental ao diminuír o factor E.
A CCC evita a desnaturalización e a perda por adsorción eliminando os soportes sólidos, preservando a integridade das biomoléculas e mellorando as taxas de recuperación.
Sí, a CCC pode escalarse desde pequenas mostras de laboratorio ata grandes lotes industriais con mínima reoptimización, o que a fai ideal para a produción de fármacos e vacinas.
EN
