Какви са предимствата на системата с противоток?

Надвисока ефективност на отделянето в системите с противоток

Как динамичното течност-течност разделяне осигурява по-висок брой теоретични плочи

Системите с противоток работят по-ефективно при разделянето на вещества, тъй като използват непрекъснато разделяне на течност в течност, което създава множество етапи на равновесие, действащи като теоретични плочи. Това, което прави тези системи специални в сравнение с традиционните методи с твърда фаза, е липсата на неподвижни носители. Това означава, че не се сблъскваме с проблеми като необратимо прилепване на вещества към повърхности или загуба на проби по време на процеса. Вместо това цялото разделяне протича естествено, изцяло въз основа на начина, по който различните съединения се разпределят между течностите. Резултатът? Можем да различаваме изключително подобни молекули, като например таксаните или различните форми на флавоноиди, които иначе биха били трудни за разграничаване. Хроматографията с противоток (CCC) обикновено постига около 3000 теоретични плочи — значително повече от стандартната ВВЕХ, която най-често достига само около 500 плочи максимум. Защо това има толкова голямо значение? Защото, когато фазите се обновяват непрекъснато и разширяването на зоните на веществата е по-малко, получаваме много по-остри върхове и по-чисти фракции. А за изследователите, които се опитват да изолират активни съставки от сложни смеси, такава прецизност просто не може да бъде надмината.

Случайно доказателство: Пуритиране на паклитаксел с високоскоростна CCC надвишава HPLC по резолюция и възстановяване

Методът на високоскоростна противотокова хроматография (HSCCC) показва ясни предимства при чистенето на паклитаксел — нестабилен противоопасен препарат, който изисква внимателно отделяне. Изследванията показват, че чрез методите HSCCC може да се възстанови около 98 % от неповредения паклитаксел, което надвишава резултатите от стандартните HPLC методи, при които възстановяването е само около 82–85 %, тъй като веществата имат тенденция да се задържат и разграждат върху кремнеземни колони. При отделянето на паклитаксел от подобни съединения като бакатин III и 10-деацетилбакатин III HSCCC постига приблизително 1,5 пъти по-добра разделителна способност. Това се дължи главно на това, че HSCCC работи в разтворена фаза, а не чрез повърхностни взаимодействия. Друго важно предимство е намаляването на разтворителя с около 60 % спрямо традиционните HPLC процеси, което прави цялата операция значително по-икономична. За лаборатории, които работят с деликатни природни продукти, където най-важно е запазването на структурата, тези резултати наистина подчертават защо HSCCC се отличава като предпочитан метод.

Запазване на биомолекулярната цялост без твърди носители

Защо разделянето с противоток без носител предотвратява денатурацията и адсорбционните загуби

Хроматографията с противоток запазва биомолекулите непокътнати, тъй като напълно елиминира твърдите фазови интерфейси. Тези интерфейси обикновено предизвикват проблеми като денатурация, агрегация и задържане/загуба на молекулите. Традиционните методи се основават на материали като кремнезем или полимерни смоли, които притежават хидрофобни участъци и всъщност оказват стрес върху конформацията на молекулите. При разпределението между две течности обаче протеините, антителата и пептидите остават изцяло в разтвор през целия процес. Според проучване, публикувано в списание „Nature“ миналата година, този подход предотвратява необратимото разгъване, което се наблюдава при около 38 % от терапевтичните протеини при използване на твърди фази. Стойностите за възстановяване се повишават с 25–40 %, а по-важното е, че ензимите запазват своята каталитична активност, а антителата – способността си да се свързват с антигени. Това прави техниката особено ценна: в нея не се прилага високо налягане, няма порести материали, които могат да се запушат, и съвсем липсват силите на срязване, които разрушават структурата. Това има голямо значение за чувствителни биологични продукти като моноклонални антитела и различни пептидни хормони, които изключително зле понасят грубото обращение.

Стабилността има голямо значение при работа с термолабилни биомолекули. Според проучване, публикувано миналата година в Journal of Bioprocessing, дори краткотрайният контакт с температури около 45 °C може да предизвика сериозни проблеми, като например необратима агрегация в колонни процеси. Затова технологията CCC се отличава — тя работи при нормално атмосферно налягане и стайна температура. Благодарение на тези предимства много лаборатории започват да преминават към противотокови методи за задачи като чистене на ваксинни антигени и различни приложения в регенеративната медицина. Тук решаващо значение има не само количеството възстановен материал, но и дали молекулите запазват своята функционалност след обработката — това определя дали целият процес е успешен или не.

Намалени експлоатационни разходи и консумация на разтворители

с 70 % по-ниско използване на органични разтворители спрямо подготовителна ВВЕХ — влияние върху Е-фактора и зеленото производство

Хроматографията с противоток намалява необходимото количество органични разтворители с около 70 % в сравнение с традиционните методи за подготовка чрез ВЕЖХ. Това означава реална икономия не само от закупуването на разтворители, но и от цялата допълнителна работа, свързана с тяхното обращение, както и с отстраняването на опасни отпадъци. Намаляването на употребата на разтворители води до понижаване на така наречения „екологичен фактор“ (E Factor) при процесите с противоток до около 24. Това е значително по-добро от обичайния диапазон от 25 до 100, наблюдаван при стандартните методи за подготовка чрез ВЕЖХ. Използването на по-малко разтворител има и други предимства: анализите стават по-бързи, оборудването изпитва по-малко натоварване, а общо взето се премахват онези досадни пречки при пуритикацията, които забавят процеса. Вземете за пример промишлената екстракция на ботанични материали: според някои скорошни изследвания, публикувани в Journal of Chromatography Comparative Analysis, количеството разтворител, необходимо за екстракцията, може да бъде намалено от обичайните 10 литра при ВЕЖХ до само 3 литра при хроматография с противоток. Всички тези подобрения означават, че хроматографията с противоток работи добре и в по-големи мащаби, без да се налага значително увеличение на разходите, и едновременно с това е по-екологична. И нека бъдем честни — този подход напълно отговаря на изискванията, които регулаторните органи предявяват днес към зелените производствени практики във фармацевтичната и нутрицевтичната индустрия.

Мащабируема биопурификация с минимална повторна оптимизация на метода

Системите с противоток правят мащабирането от малки лабораторни тестове (например проби от 1 mL или 10 mL) чак до големи промишлени серии (понякога до 1000 литра) сравнително лесно, като почти не се налага повторна настройка. Магията се крие в това, че те се основават на основната термодинамика на разделянето, а не на такива фактори като формата на колоната, степента на уплътняване на пълнежа или скоростта на потока, която влияе върху масовия пренос. Това означава на практика, че изследователите могат да използват едни и същи разтворители и съотношения на потоците независимо от това дали работят с миниатюрно или голямо оборудване. Много лаборатории всъщност прехвърлят своите методи направо от 1-литрова установка към 1000-литрова, без да променят нищо в съотношенията на фазите, скоростите на въртене или профилите на градиентите, които всички толкова обсъждат. Такава последователност спестява на компаниите около половината време, което обикновено се изразходва за валидиране на процесите, и избягва скъпите етапи на повторно разработване. За производителите на сложни биологични лекарства, ваксини или дори растителни лекарствени продукти способността за бързо мащабиране означава по-бързо доставяне на продуктите до пациентите и намаляване на рисковете при извеждането им на пазара. Затова хроматографията с противоток е станала толкова важен инструмент за всеки, който сериозно се занимава с модерните методи за биопочистване.