Системи противтока раде боље на раздвајању супстанци јер користе континуирано раздвајање течности на течност, што ствара више равнотежних фаза које делују као теоријске плоче. Оно што ове системе чини посебним у поређењу са традиционалним методама чврсте фазе јесте да нису укључени стационарни потпори. То значи да немамо проблема са стварима које се неповратно лепе на површине или губе узорке током процеса. Уместо тога, све се природно раздваја на основу чистог расподељавања различитих једињења између течности. Шта је било резултат? Можемо раздвојити веома сличне молекуле као што су таксани или различити облици флавоноида који би иначе били тешко разликовати. Противточна хроматографија или ЦЦЦ обично удара око 3000 теоријских плоча, много више него што стандардни ХПЛЦ управља већином времена, који обично зауставља око 500 плоча максимум. Зашто је ово толико важно? Јер када се фазе свеже и мање се шире из супстанцијских појаса, добијамо много оштрије врхове и чистије фракције. И за истраживаче који покушавају да извуку активне састојке из компликованих мешавина, оваква прецизност је непобијена.
Метода високобрзне контратекусне хроматографије (ХСЦЦЦ) показује јасне предности при пречишћавању паклитаксела, нестабилног противораковног једињења које треба пажљиво изоловати. Истраживања показују да се око 98% нетакнутог паклитаксела може опоравити методама ХСЦЦЦ, које су боље од стандардних ХПЛЦ метода које се користе само око 82 до 85%, јер се једињења имају тенденцију да се причвршћују и разграђују на колонама силиција. Када је реч о одвајању паклитаксела од сличних супстанци као што су баккатин III и 10- деацетилбакатин III, ХСЦЦЦ постиже око 1, 5 пута бољу резолуцију. Ово се углавном дешава зато што ХСЦЦЦ ради у фази раствора, а не ослањајући се на површинске интеракције. Још један велики плус је да се употреба растварача смањује за око 60% у поређењу са традиционалним ХПЛЦ процесима, што чини целу операцију много економичнијом. За лабораторије које раде са деликатним природним производима, где је одржавање структуре нетакнуте најважније, ови резултати заиста наглашавају зашто се ХСЦЦК истиче као омиљени избор.
Хроматографија против струје одржава биомолекуле нетакнутим јер се потпуно ослобођује тих интерфејса чврсте фазе. Ови интерфејси су обично узрочни проблеми као што су денатурација, агрегација, и када се молекули заглави и изгубе. Традиционалне методе се ослањају на ствари попут силицијског или полимерских смола које имају хидрофобне тачке које заправо наглашавају облике молекула. Али са течном раздвајањем течности, протеини, антитела и пептиди остају у раствору током целог процеса. Према истраживању објављеном у "Природи" прошле године, овај приступ зауставља необративо отварање проблема који се дешава у око 38% терапеутских протеина када се користе методе чврсте фазе. Бројеви опоравка се повећавају између 25% и 40%, а што је важно, ензими и даље раде исправно, а антитела одржавају своју способност да везују антигене. Оно што ову технику чини тако вредном је то што кроз њу не пролази велики притисак, нема порезних материјала који би се запљушили, и дефинитивно нема силе ширења која би раскидала ствари. Ово је веома важно за осетљиве биолошке супстанце као што су моноклонална антитела и разне пептидне хормоне који се не могу добро носити са грубом руком.
| Метода одвајања | Ризик од денатурације | Адсорптивни губитак | Структурна интегритет |
|---|---|---|---|
| Тврда фаза | Висок | 15–30% | У компромису |
| Противточна струја | Незначан | <5% | Конзервирани |
Стабилност је веома важна када се ради о биомолекулама осетљивим на топлоту. Само кратки контакт са температурама око 45 степени Целзијуса може изазвати озбиљне проблеме као што је неповратна агрегација у процесима заснованим на колонама, према истраживању објављеном у часопису Journal of Bioprocessing прошле године. Зато се ЦЦЦ технологија истиче јер ради на нормалном комнатском притиску и температури. Због ових предности, многе лабораторије су почеле да се примјењују на противрекујуће методе за ствари као што су прочишћење антигена вакцина и различите апликације регенеративне медицине. Оно што се заиста рачуна овде није само колико материјала се опорави, већ да ли ће ти молекули остати функционални након обраде што одређује да ли је цела операција успешна или не.
Противточна хроматографија смањује потребне органске раствараче за око 70% у поређењу са традиционалним методама препа HPLC. То значи да се не само штеде новац на куповини растварача већ и на све додатне напоре које се односе на њихово руковање и на управљање опасним отпадом. Пад употребе растворача смањује оно што хемичари називају фактором животне средине или Е-фактором на око 24 за ЦЦЦ процесе. То је много боље од уобичајеног опсега од 25 до 100 који се види са стандардним препа HPLC техникама. Коришћење мање растварача има и друге предности - чини да се вози брже, мање наметне системе опреме и генерално изглађује оне досадне пречистилосне препреке које успоравају ствари. Узмите као пример индустријску ботаничку екстракцију. Оно што би обично требало 10 литара растварача са преп ХПЛЦ-ом може се урадити само са 3 литра користећи ЦЦЦ према неком недавном тесту у часопису Journal of Chromatography Comparative Analysis. Све ово значи да ЦЦЦ добро ради у већим обимама без кршења банке, а истовремено је добар за животну средину. И да се суочимо са тим, овакав приступ се упише у оно што регулатори траже данас у практици зелене производње у фармацеутској и нутрацеутској индустрији.
Системи противтока чине да се мањи лабораторијски тестови (као што су проби од 1 или 10 мл) све до великих индустријских промјера (понекад чак и до 1.000 литара) прилично једноставно, без потребе за новим прилагођавањем ствари. Магија се дешава зато што се базира на основној термодинамици преграде уместо ствари као што су облик стуба, колико је све чврсто упаковано, или стопе проток који утичу на пренос масе. То значи у пракси да истраживачи могу да користе исте растворитеље и протокне односе без обзира да ли раде са малом или малом опремом. Многе лабораторије су своје методе превели од 1 литарске на 1000 литарску, без промене фазног односа, брзине ротације или профила градијента о којима се сви толико брину. Оваква конзистенција штеди компанијама око половине времена које би обично потрошиле на валидацију процеса и избегава скупе рунде редевалпемента. За људе који производе компликоване биолошке лекове, вакцине, па чак и биљне лекове, та способност брзог ширења значи брже доносити производе пацијентима и истовремено смањети ризике када их увезу на тржиште. Зато је контратокова хроматографија постала тако важна алатка за све који су озбиљни у погледу модерних техника биопречишћења.
Противточна хроматографија (КЦЦ) је процес раздвајања течности и течности без стационарне фазе, што избегава проблеме као што су неповратна адсорпција и губитак узорка који се виде у методама чврсте носаче.
ЦЦЦ постиже до 3000 теоријских плоча, премашујући просечне 500 плоча стандардног ХПЛЦ-а, што резултира већом резолуцијом и чистијим сепарацијама.
ЦЦЦ користи до 70% мање органских растварача од преп-ХПЛЦ-а, смањујући оперативне трошкове и утицај на животну средину смањењем Е-фактора.
ЦЦЦ избегава денатурацију и адсорптивни губитак елиминисањем чврстих носача, очувањем биомолекуларног интегритета и побољшањем стопе опоравка.
Да, ЦЦЦ може да се прошири од малих лабораторијских узорака до великих индустријских баца са минималним ре-оптимализацијом, што га чини идеалним за производњу лекова и вакцина.
EN
