Vastuvoolusüsteemid eraldavad aineid paremini, kuna nad kasutavad pidevat vedeliku-vedeliku jaotumist, mis loob mitu tasakaalustatud etappi, toimides nagu teoreetilised plastid. Sellest, mis teeb need süsteemid eriliseks võrreldes traditsiooniliste tahkete faaside meetoditega, on see, et neis ei osale staatsioonarid toed. See tähendab, et meil ei tekki probleeme aine osade pöördumatuga kleepumisega pinnale ega proovide kaotamisega protsessi käigus. Pigem eralduvad kõik ained loomulikult ainult selle põhjal, kuidas erinevad ühendid jaotuvad vedelike vahel. Tulemus? Me saame eristada väga sarnaseid molekule, näiteks taksaane või erinevaid flavonoidide vorme, mida muul viisil oleks raske eristada. Vastuvoolukromatograafia (CCC) saavutab tavaliselt umbes 3000 teoreetilist platti, palju rohkem kui standardne HPLC enamasti suudab – see jõuab tavaliselt maksimaalselt umbes 500 platini. Miks on see nii tähtis? Sellepärast, et kui faasid jätkuvad värskendamist ja ainepiirkondade laienemine on väiksem, saavutame palju teravnemad tipud ja puhtamad fraktsioonid. Ja teadusuuringute tegijatele, kes püüavad keerukatest seguist välja eraldada aktiivseid koostisosasid, pole seda täpsust võimalik ületada.
Kõrgkiirusliku vastuvoolu kromatograafia (HSCCC) meetod näitab selgeid eeliseid paclitakseli, st ebastabiilse päritolu ravimi puhastamisel, mille jaoks on vajalik ettevaatlik eraldamine. Uuringud näitavad, et HSCCC-tehnikatega saab taastada umbes 98% terviklikust paclitakselist, mis on parem kui standardsete HPLC-meetodite tulemus (umbes 82–85%), kuna ühendid tenditsid kleepuma ja lagunema silikoonveergudel. Paclitakseli eraldamisel sarnaste ainete, näiteks bakkatiin III ja 10-deatsetüül-bakkatiin III, vahel saavutab HSCCC umbes 1,5-kordse parema lahutusvõime. See juhtub peamiselt seetõttu, et HSCCC toimib lahuses faasis, mitte pinnasinteraktsioonidele tuginedes. Teine suur pluss on see, et lahustite kasutus väheneb umbes 60% võrra võrreldes traditsiooniliste HPLC-protsessidega, mistõttu muutub kogu operatsioon palju kuluefektiivsemaks. Laborites, kus töötatakse õrnade looduslike toodetega ja kus struktuuri säilitamine on kõige tähtsam, rõhutavad need tulemused tõesti, miks HSCCC on eelistatud valik.
Vastavoolu kromatograafia säilitab biomolekulid terviklikuna, kuna see eemaldab tahked faasipiirpinnad täielikult. Just need piirpinnad põhjustavad tavaliselt probleeme, nagu denatureerumine, agregaatumite moodustumine ning molekulide kinnijäämine ja kaotumine. Traditsioonilised meetodid toetuvad sellistele materjalidele nagu silika või polümeerresinad, millel on hüdrofoobsed kohad, mis tegelikult molekule nende kuju poolest pingutavad. Kuid vedeliku-vedeliku jaotumise puhul jäävad valgud, antikehad ja peptiidid kogu protsessi vältel lahuses. Viimase aasta Nature’is avaldatud uuringute kohaselt takistab see lähenemisviis irreversiivset lahenemist, mis esineb umbes 38% ravimvalkude puhul tahkefaasimeetodite kasutamisel. Taastumismäär tõuseb 25–40% võrra ja oluliselt säilib ka ensüümide bioloogiline aktiivsus ning antikehade võime siduda antigeene. Selle tehnikaga seotud erilise väärtuse annab asjaolu, et selles ei kasutata kõrgsurvet, ei ole poroosseid materjale, milles saaks ummistuda, ja kindlasti puuduvad ka kahjulikud liugumisjõud. See on eriti oluline tundlike bioloogiliste ainete, näiteks monoklonaalsete antikehade ja mitmesuguste peptiidhormoonide puhul, mis üldse ei talu karmi käsitlust.
| Eraldamismeetod | Denatureerumisohu | Sorptsioonikaotus | Struktuuri terviklikkuse |
|---|---|---|---|
| Tahke faas | Kõrge | 15–30% | Kompromiteeritud |
| Kontravool | Ebaoluline | <5% | Hoidnud |
Stabiilsus on väga oluline soojuslikult tundlike biomolekulide töötlemisel. Väga lühike kokkupuude umbes 45 °C juures võib põhjustada tõsiseid probleeme, näiteks irreversiivset agregaatumit tekkitavaid protsesse veerupõhistes süsteemides, nagu viimase aasta ajakirjas Journal of Bioprocessing avaldatud uuringus kirjeldatud. Seetõttu eristub CCC-tehnoloogia, kuna see toimib tavapärastes ruumitemperatuuri ja rõhu tingimustes. Nende eeliste tõttu on paljud laborid juba alanud üleminekut kontravoolumeetoditele, näiteks vaktsiiniantigeenide ja mitmesuguste regeneratiivmeditsiini rakenduste puhastamisel. Siin loeb tegelikult mitte ainult see, kui palju materjali taastatakse, vaid ka see, kas molekulid säilitavad pärast töötlemist oma funktsionaalsuse – just see määrab, kas kogu operatsioon oli edukas või mitte.
Vastuvoolu kromatograafia vähendab orgaaniliste lahustite tarbimist umbes 70% võrreldes traditsiooniliste preparatiivsete HPLC-meetoditega. See tähendab tegelikku raha säästmist mitte ainult lahustite ostmisel, vaid ka kogu nende käsitsemisega seotud lisatöö ja ohtlike jäätmete haldamisega. Lahustite tarbimise vähenemine vähendab keemikute poolt kasutatavat keskkonnategurit (E-tegurit) CCC-protsesside puhul umbes 24-ni – see on palju parem kui tavaline vahemik 25–100, mida saavutatakse standardsete preparatiivsete HPLC-tehnikatega. Väiksem lahustite tarbimine annab ka teisi eeliseid: analüüsid toimuvad kiiremini, seadmete süsteemidele avaldub vähem koormust ja üldiselt sujuvustatakse neid tüütuid puhastusprotsessi takistusi, mis aeglustavad tööd. Näiteks tööstuslikus masstasandil toimuvate taimsete ekstraktide saamisel võimaldab CCC mõningate hiljutiste katsete kohaselt ajakirjas Journal of Chromatography Comparative Analysis seda, mida tavaliselt preparatiivse HPLC-ga teha 10 liitri lahustiga, teha vaid 3 liitri lahustiga. Kõik need parandused tähendavad, et CCC töötab hästi ka suurematel skaaladel, ilma et see maksma läheks, samas kui see on ka keskkonnasõbralik. Ja tõde on see, et selline lähenemisviis sobib täielikult tänapäevaste regulaatorite nõudmistega rohelise tootmise valdkonnas nii farmatsia- kui ka toitumisabiainete tööstuses.
Vastavoolusüsteemid muudavad skaala suurendamise väikestest laborikatsetest (näiteks 1 mL või 10 mL proovidega) kuni suurteni tööstuslikute tootmisteenusteni (mõnikord kuni 1000 liitrit) üsna lihtsaks, peaaegu ilma vajaduseta korrata seadistusi. See «maagia» toimub sellepärast, et süsteem põhineb põhimõttelisel jaotumistermodynamiikal, mitte sellistel teguritel nagu kolonni kuju, täitmise tihedus või massivahetust mõjutavad voolukiirused. Praktikas tähendab see, et teadusuuringute tegijad saavad kasutada samu lahusteid ja voolusuhteid olenemata sellest, kas nad töötavad väikese või väga suure varustusega. Paljud laborid rakendavad oma meetodeid otse 1-liitrises seadmes 1000-liitrisesse seadmesse, ilma et muutaks faasisuhteid, pöörlemiskiirusi või neid gradientprofiele, mille üle inimesed nii palju muresid. Selline järjepidevus säästab ettevõtetelt umbes poole aeg, mida nad tavaliselt kulutaksid protsesside kehtestamisele, ning vältib kalliste taasarenduste ringe. Inimestele, kes valmistavad keerukaid bioloogilisi ravimeid, vaktsiine või isegi taimset päritolu ravimeid, tähendab see kiiret skaalautõusu võimalust saada tooted kiiremini patsientide juurde ning vähendada riski nende turuletoomisel. Seetõttu on vastavoolukromatograafia muutunud oluliseks tööriistaks kõigile, kes võtavad tõsiselt kaasaegseid biopuhastustehnikaid.
Vastuvoolu kromatograafia (CCC) on vedelik-vedelik eraldusprotsess ilma statsionaarse faasita, mis vältib pöördumatut adsorptsiooni ja proovikaotusi, mida täheldatakse tahkete kandjatega meetodites.
CCC saavutab kuni 3000 teoreetilist plastit, ületades standardse HPLC keskmiselt 500 plastit, mis tagab kõrgema lahutusvõime ja puhtamad eraldused.
CCC kasutab kuni 70% vähem orgaanilisi lahusteid kui preparatiivne HPLC, vähendades seega töökulusid ja keskkonnamõju, st E-faktorit.
CCC vältib denatureerumist ja adsorptiivset kaotust, kuna see ei kasuta tahkeid kandjaid, säilitades seega biomolekulide terviklikkuse ja parandades taastumismäärasid.
Jah, CCC on skaalatav väikestest laboriproovidest suurtesse tööstuslikesse partiidesse minimaalse uuestioptimeerimisega, mistõttu on see ideaalne ravimite ja vaktsiinide tootmiseks.
EN
