Sistemi s prototokom delujejo bolje pri ločevanju snovi, ker uporabljajo neprekinjeno tekočinsko-tekočinsko razdelitev, kar ustvari več ravnotežnih stopenj, ki delujejo kot teoretične plošče. Kar naredi te sisteme posebnimi v primerjavi z tradicionalnimi metodami na trdni fazi, je odsotnost nepremičnih nosilcev. To pomeni, da se izognemo težavam, kot so neobrnjivo vezava snovi na površine ali izguba vzorcev med postopkom. Namesto tega se vse loči naravno izključno na podlagi tega, kako se različne spojine porazdelijo med tekočinami. Kaj pa je rezultat? Lahko ločimo zelo podobne molekule, kot so npr. takzani ali različne oblike flavonoidov, ki bi jih sicer bilo težko razlikovati. Kromatografija s prototokom (CCC) običajno doseže približno 3000 teoretičnih plošč, kar je veliko več kot standardna HPLC, ki večinoma doseže največ približno 500 plošč. Zakaj je to tako pomembno? Ker se faze neprestano osvežujejo in pride do manj razširjanja pasov snovi, kar povzroči bistveno ostriše vrhove in čistejše frakcije. Za raziskovalce, ki poskušajo iz zapletenih mešanic izločiti aktivne sestavine, ta vrsta natančnosti preprosto nima konkurence.
Metoda visokohitrostne protitokovne kromatografije (HSCCC) kaže jasne prednosti pri čiščenju paklitaksla, nestabilnega protirakavega spojina, ki zahteva previdno izolacijo. Raziskave kažejo, da se z metodami HSCCC lahko obnovi približno 98 % netaktnega paklitaksla, kar je boljše od standardnih metod HPLC, ki dosežejo le približno 82 do 85 %, saj se spojine pogosto vezujejo na silikatne stolpce in na njih razgrajujejo. Pri ločevanju paklitaksla od podobnih snovi, kot sta baccatin III in 10-deacetilbaccatin III, HSCCC doseže približno 1,5-krat višjo ločljivost. To se zgodi predvsem zato, ker HSCCC deluje v raztopinski fazi namesto, da bi se zanašala na površinske interakcije. Še ena pomembna prednost je zmanjšanje porabe topil za približno 60 % v primerjavi s tradicionalnimi procesi HPLC, kar naredi celoten postopek znatno bolj ekonomičnega. Za laboratorije, ki delajo z občutljivimi naravnimi izdelki, kjer je najpomembnejše ohraniti strukturo netaktno, ti rezultati resnično poudarjajo, zakaj je HSCCC prednostna izbira.
Kromatografija s prototokom ohrani biomolekule nedotaknjene, saj popolnoma odstrani trdne fazne meje. Te meje so običajno vzrok za težave, kot so denaturacija, agregacija in zadrževanje ter izguba molekul. Tradicionalne metode uporabljajo materiala, kot sta silika ali polimerni smoli, ki vsebujejo hidrofobna mesta, ki dejansko povzročajo napetost v obliki molekul. Pri tekočinsko-tekočinskem razdelitvenem postopku pa ostanejo beljakovine, protitelesa in peptidi skozi celoten proces v raztopini. Glede na raziskavo, objavljeno v časopisu Nature lani, ta pristop preprečuje neobrnjivo razvijanje, ki se pri približno 38 % terapevtskih beljakovin pojavi pri uporabi metod s trdno fazo. Stopnja izkoriščanja se poveča za 25 % do 40 %, pomembno pa je tudi to, da encimi še naprej pravilno delujejo, protitelesa pa ohranjajo svojo sposobnost vezave antigenov. Vrednost te tehnike izhaja iz dejstva, da skozi njo ni visokega tlaka, ni poroznih materialov, ki bi se lahko zamašili, in zagotovo ni strižnih sil, ki bi raztrgale molekule. To je zelo pomembno za občutljive biološke snovi, kot so monoklonska protitelesa in različni peptidni hormoni, ki sploh ne prenašajo grobe obravnave.
| Metoda ločevanja | Tveganje denaturacije | Adsorpcijski izgubi | Strojna celovitost |
|---|---|---|---|
| Trdofazno | Visoko | 15–30% | Kompromitirano |
| Prototok | Zanemarljiv | <5% | Zachranjena |
Stabilnost je zelo pomembna pri delu s toplotno občutljivimi biomolekulami. Že kratek stik z temperaturami okoli 45 stopinj Celzija lahko povzroči resne težave, kot je npr. nepovrnljiva agregacija v stolpčnih postopkih, kar so predlagali raziskave, objavljene lani v časopisu Journal of Bioprocessing. Zato se tehnologija CCC izpostavlja, saj deluje pri običajnem sobnem tlaku in temperaturah. Zaradi teh prednosti so številna laboratoriji začela prehajati na metode prototoka za npr. čiščenje vakcinskih antigenov in različne aplikacije regenerativne medicine. Tukaj ni pomembno le to, koliko materiala se obnovi, temveč tudi, ali ostanejo molekule funkcionalne po obdelavi – kar določa uspešnost celotnega procesa.
Kromatografija z nasprotnim tokom zmanjša potrebo po organskih topilih za približno 70 % v primerjavi s tradicionalnimi pripravnimi HPLC-metodami. To pomeni resnično varčevanje s sredstvi – ne le pri nakupu topil, temveč tudi pri vseh dodatnih opravilih, povezanih z njihovo ravnanjem, ter pri ravnanju z nevarnimi odpadki. Zmanjšanje porabe topil zniža tako imenovani ekološki faktor (E-faktor) za CCC-procese na približno 24. To je znatno bolje od običajnega razpona 25 do 100, ki ga pri standardnih pripravnih HPLC-tehnikah opazimo. Zmanjšana poraba topil prinaša še druge prednosti: analize potekajo hitreje, oprema in sistemi so manj obremenjeni ter se na splošno odpravijo nadležne ovire pri čiščenju, ki počasnijo celoten proces. Vzemimo za primer industrijsko izvleček rastlinskega materiala. Kar bi običajno zahtevalo 10 litrov topila pri pripravnem HPLC-ju, je mogoče po nekaterih nedavnih preskusih, objavljenih v časopisu Journal of Chromatography Comparative Analysis, izvesti z le 3 litri topila z uporabo kromatografije z nasprotnim tokom. Vse te izboljšave pomenijo, da kromatografija z nasprotnim tokom uspešno deluje tudi na večjih merilnih lestvicah brez prekomernih stroškov, hkrati pa ostaja okolju prijazna. In poglejmo resnico v oči: takšen pristop se popolnoma ujema z zahtevami regulatorjev glede zelenih proizvodnih praks v farmacevtski in nutraceutski industriji.
Sistemi s prototokom omogočajo preprosto povečanje merila od majhnih laboratorijskih preskusov (npr. vzorcev prostornine 1 mL ali 10 mL) do velikih industrijskih procesov (včasih celo do 1000 litrov), pri čemer je skoraj nič potrebe po ponovnem prilagajanju parametrov. Čarodejstvo deluje, ker temelji na osnovni termodinamiki razdelitve namesto na dejavnikih, kot so oblika kolone, stopnja zbijanja materiala ali hitrost pretoka, ki vplivajo na prenos mase. V praksi to pomeni, da lahko raziskovalci uporabljajo ista topila in iste razmerja pretoka ne glede na to, ali delajo z majhnimi ali zelo velikimi napravami. Številna laboratorija dejansko neposredno preneso svoje metode iz nastavitve za 1 liter na nastavitev za 1000 litrov brez kakršnih koli sprememb razmer faz, vrtilnih hitrosti ali profilov gradientov, zaradi katerih se vsi tako zanima. Takšna doslednost podjetjem prihrani približno polovico časa, ki bi ga sicer porabili za potrditev procesov, ter izogne dragim ciklom ponovnega razvijanja. Za tiste, ki proizvajajo zapletene biološke zdravila, cepiva ali celo rastlinska zdravila, pomeni ta sposobnost hitrega povečanja merila hitrejšo dostavo izdelkov pacientom ter zmanjšanje tveganj ob uvedbi izdelkov na trg. Zato se kromatografija s prototokom izkazala kot zelo pomembno orodje za vse, ki resno razmišljajo o sodobnih tehnikah biopurifikacije.
Prototokovna kromatografija (CCC) je tekočinsko-tekočinska ločitvena metoda brez nepremične faze, ki izogne problemom, kot so neobrnjiva adsorpcija in izguba vzorca, ki jih opazimo pri metodah z trdnimi nosilci.
CCC doseže do 3000 teoretičnih plošč, kar presega povprečnih 500 plošč standardne HPLC, kar vodi do višje ločilne moči in čistejših ločitev.
CCC uporablja do 70 % manj organskih topil kot pripravna HPLC, kar znižuje obratovalne stroške in okoljski vpliv ter zmanjšuje faktor E.
CCC izogne denaturaciji in adsorpcijski izgubi z odstranitvijo trdnih nosilcev, s čimer ohrani celovitost biomolekul in izboljša stopnjo povračila.
Da, CCC se lahko razmerja od majhnih laboratorijskih vzorcev do velikih industrijskih serij z minimalno ponovno optimizacijo, kar jo naredi idealno za proizvodnjo zdravil in cepiv.
EN
