Τα συστήματα αντίρροιας λειτουργούν καλύτερα στον διαχωρισμό ουσιών, επειδή χρησιμοποιούν συνεχή υγρό-υγρό διαχωρισμό, ο οποίος δημιουργεί πολλαπλά στάδια ισορροπίας που λειτουργούν ως θεωρητικές πλάκες. Αυτό που καθιστά αυτά τα συστήματα ιδιαίτερα σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους στερεάς φάσης είναι ότι δεν περιλαμβάνουν καθόλου σταθερά στηρίγματα. Αυτό σημαίνει ότι δεν αντιμετωπίζουμε προβλήματα όπως η ανεπανόρθωτη προσκόλληση ουσιών σε επιφάνειες ή η απώλεια δειγμάτων κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Αντίθετα, ο διαχωρισμός πραγματοποιείται αποκλειστικά και μόνο με φυσικό τρόπο, βάσει του τρόπου με τον οποίο διανέμονται οι διάφορες ενώσεις μεταξύ των υγρών φάσεων. Το αποτέλεσμα; Μπορούμε να διακρίνουμε με ακρίβεια πολύ παρόμοια μόρια, όπως οι ταξάνες ή διάφορες μορφές φλαβονοειδών, τα οποία διαφορετικά θα ήταν δύσκολο να διαχωριστούν. Η Χρωματογραφία Αντίρροιας (Counter Current Chromatography ή CCC) επιτυγχάνει συνήθως περίπου 3000 θεωρητικές πλάκες, πολύ περισσότερες από όσες επιτυγχάνει η τυπική HPLC το μεγαλύτερο μέρος του χρόνου, η οποία συνήθως δεν ξεπερνά τις 500 πλάκες. Γιατί έχει τόση σημασία αυτό; Διότι, όταν οι φάσεις ανανεώνονται συνεχώς και η διάχυση των ζωνών των ουσιών είναι μικρότερη, επιτυγχάνουμε πολύ οξύτερες κορυφές και καθαρότερα κλάσματα. Και για τους ερευνητές που προσπαθούν να απομονώσουν δραστικά συστατικά από περίπλοκα μείγματα, αυτό το επίπεδο ακρίβειας είναι ανυπέρβλητο.
Η μέθοδος της Υψηλής Ταχύτητας Αντίθετης Ροής Χρωματογραφίας (HSCCC) παρουσιάζει σαφείς πλεονεκτήματα κατά τον καθαρισμό του πακλιταξέλη, ενός ασταθούς αντικαρκινικού ενώσεως που απαιτεί προσεκτική απομόνωση. Έρευνες δείχνουν ότι περίπου το 98% του αναλλοίωτου πακλιταξέλη μπορεί να ανακτηθεί μέσω τεχνικών HSCCC, γεγονός που υπερβαίνει τις συνηθισμένες μεθόδους HPLC, οι οποίες επιτυγχάνουν μόνο περίπου 82 έως 85%, καθώς οι ενώσεις τείνουν να προσκολλώνται και να διασπώνται σε στήλες πυριτικού οξέος. Όσον αφορά τον διαχωρισμό του πακλιταξέλη από παρόμοιες ουσίες, όπως το βακκατίνη III και το 10-δεακετυλβακκατίνη III, η HSCCC επιτυγχάνει περίπου 1,5 φορές καλύτερη ανάλυση. Αυτό συμβαίνει κυρίως επειδή η HSCCC λειτουργεί σε φάση διαλύματος, αντί να βασίζεται σε επιφανειακές αλληλεπιδράσεις. Ένα ακόμη σημαντικό πλεονέκτημα είναι ότι η κατανάλωση διαλυτών μειώνεται κατά περίπου 60% σε σύγκριση με τις παραδοσιακές διαδικασίες HPLC, κάνοντας ολόκληρη τη διαδικασία πολύ πιο οικονομικά αποδοτική. Για εργαστήρια που εργάζονται με ευαίσθητα φυσικά προϊόντα, όπου η διατήρηση της αναλλοίωτης δομής είναι το σημαντικότερο κριτήριο, αυτά τα αποτελέσματα τονίζουν πραγματικά τον λόγο για τον οποίο η HSCCC ξεχωρίζει ως η προτιμώμενη επιλογή.
Η χρωματογραφία αντίρρευστης φάσης διατηρεί τα βιομόρια ανέπαφα, καθώς ελέγχει πλήρως τις διεπιφάνειες στερεάς φάσης. Αυτές οι διεπιφάνειες είναι συνήθως υπεύθυνες για προβλήματα όπως η αποδιάταξη, η συσσώρευση και η προσκόλληση/απώλεια μορίων. Οι παραδοσιακές μέθοδοι βασίζονται σε υλικά όπως η πυριτική άμμος ή ρητίνες πολυμερών, τα οποία περιέχουν υδρόφοβες περιοχές που προκαλούν στρες στη δομή των μορίων. Αντίθετα, με την κατανομή υγρού-υγρού, οι πρωτεΐνες, τα αντισώματα και τα πεπτίδια παραμένουν εντελώς διαλυμένα σε όλη τη διάρκεια της διαδικασίας. Σύμφωνα με έρευνα που δημοσιεύθηκε πέρυσι στο περιοδικό Nature, αυτή η προσέγγιση αποτρέπει το φαινόμενο της αναστρέψιμης αναδίπλωσης, το οποίο παρατηρείται σε περίπου το 38% των θεραπευτικών πρωτεϊνών όταν χρησιμοποιούνται μέθοδοι στερεάς φάσης. Τα ποσοστά ανάκτησης αυξάνονται κατά 25% έως 40%, ενώ, σημαντικότερο, οι ενζυμικές δραστηριότητες διατηρούνται πλήρως και τα αντισώματα διατηρούν την ικανότητά τους να δεσμεύουν αντιγόνα. Η μεγάλη αξία αυτής της τεχνικής οφείλεται στο ότι δεν απαιτεί υψηλή πίεση, δεν χρησιμοποιεί πορώδη υλικά που μπορούν να φρακτούν και, σίγουρα, δεν προκαλεί δυνάμεις διάτμησης που καταστρέφουν τα ευαίσθητα βιολογικά μόρια. Αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία για ευαίσθητα βιολογικά προϊόντα, όπως τα μονοκλωνικά αντισώματα και διάφορες πεπτιδικές ορμόνες, τα οποία δεν αντέχουν καθόλου την ακραία χειριστική επιβάρυνση.
| Μέθοδος Διαχωρισμού | Κίνδυνος Δενατούρωσης | Απώλεια λόγω προσρόφησης | Δομική ακεραιότητα |
|---|---|---|---|
| Στερεή φάση | Υψηλές | 15–30% | Επικίνδυνο |
| Αντίρροπη ροή | Αμελητέα | <5% | Διατηρήθηκε |
Η σταθερότητα έχει μεγάλη σημασία κατά τον χειρισμό βιομορίων ευαίσθητων στη θερμότητα. Ακόμα και σύντομη επαφή με θερμοκρασίες περίπου 45 °C μπορεί να προκαλέσει σοβαρά προβλήματα, όπως ανεπανόρθωτη συσσώρευση σε διαδικασίες με στήλες, σύμφωνα με έρευνα που δημοσιεύθηκε πέρυσι στο Journal of Bioprocessing. Γι’ αυτό το λόγο η τεχνολογία CCC ξεχωρίζει, καθώς λειτουργεί σε κανονικές συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας δωματίου. Λόγω αυτών των πλεονεκτημάτων, πολλά εργαστήρια έχουν αρχίσει να μεταβαίνουν σε μεθόδους αντίρροπης ροής για εφαρμογές όπως η καθαρισμός αντιγόνων εμβολίων και διάφορες εφαρμογές στην αναγεννητική ιατρική. Αυτό που πραγματικά μετράει εδώ δεν είναι απλώς η ποσότητα του υλικού που ανακτάται, αλλά κατά πόσο τα μόρια παραμένουν λειτουργικά μετά την επεξεργασία — κάτι που καθορίζει εάν η συνολική διαδικασία ήταν επιτυχής ή όχι.
Η χρωματογραφία με αντίρροπη ροή (Counter Current Chromatography, CCC) μειώνει κατά περίπου 70% τη χρήση οργανικών διαλυτών σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους προετοιμασίας HPLC. Αυτό σημαίνει πραγματική οικονομία όχι μόνο στην αγορά διαλυτών, αλλά και στο επιπλέον έργο που συνεπάγεται η χειρισμός τους, καθώς και η διαχείριση επικίνδυνων αποβλήτων. Η μείωση της κατανάλωσης διαλυτών μειώνει τον λεγόμενο «παράγοντα περιβάλλοντος» ή E-Factor σε περίπου 24 για τις διαδικασίες CCC — πολύ καλύτερο αποτέλεσμα από το συνηθισμένο εύρος 25 έως 100 που παρατηρείται με τις τυπικές τεχνικές προετοιμασίας HPLC. Η μειωμένη χρήση διαλυτών προσφέρει και άλλα πλεονεκτήματα: επιταχύνει τις αναλύσεις, επιβαρύνει λιγότερο τα συστήματα εξοπλισμού και εξομαλύνει γενικότερα εκείνα τα ενοχλητικά εμπόδια καθαρισμού που επιβραδύνουν τη διαδικασία. Για παράδειγμα, στη βιομηχανικής κλίμακας εξαγωγή φυτικών ουσιών, όσοι 10 λίτρα διαλύτη απαιτούνται συνήθως με την προετοιμασία HPLC μπορούν να μειωθούν σε μόλις 3 λίτρα με τη χρήση CCC, σύμφωνα με πρόσφατες δοκιμές που δημοσιεύθηκαν στο Journal of Chromatography Comparative Analysis. Όλες αυτές οι βελτιώσεις σημαίνουν ότι η CCC λειτουργεί αποτελεσματικά και σε μεγαλύτερες κλίμακες χωρίς να επιβαρύνει υπερβολικά τον προϋπολογισμό, ενώ παράλληλα είναι φιλική προς το περιβάλλον. Και ας το πούμε ειλικρινά: αυτή η προσέγγιση ανταποκρίνεται ακριβώς στις απαιτήσεις που οι ρυθμιστικές αρχές θέτουν σήμερα για τις πρακτικές «πράσινης» παραγωγής στις φαρμακευτικές και νουτρακευτικές βιομηχανίες.
Τα συστήματα αντίρρευστης ροής καθιστούν την κλιμάκωση από μικρές εργαστηριακές δοκιμές (όπως αυτές με δείγματα 1 mL ή 10 mL) μέχρι μεγάλες βιομηχανικές παραγωγές (μερικές φορές μέχρι και 1.000 λίτρα) εξαιρετικά απλή, με σχεδόν καθόλου ανάγκη επαναρύθμισης. Το «μαγικό» αυτό αποτέλεσμα επιτυγχάνεται επειδή βασίζεται στη θερμοδυναμική κατανομής, αντί για παράγοντες όπως το σχήμα της στήλης, η πυκνότητα συμπίεσης των υλικών ή οι ρυθμοί ροής που επηρεάζουν τη μεταφορά μάζας. Στην πράξη, αυτό σημαίνει ότι οι ερευνητές μπορούν να χρησιμοποιούν τους ίδιους διαλύτες και τους ίδιους λόγους ροής, ανεξάρτητα από το αν εργάζονται με μικροσκοπικό ή μεγάλο εξοπλισμό. Πολλά εργαστήρια μεταφέρουν ακριβώς τις μεθόδους τους από μια ρύθμιση 1 λίτρου σε μια ρύθμιση 1.000 λίτρων, χωρίς να αλλάζουν καθόλου τους λόγους φάσεων, τις ταχύτητες περιστροφής ή τα προφίλ κλίσης που τόσο πολύ απασχολούν όλους. Αυτού του είδους η συνοχή εξοικονομεί στις εταιρείες περίπου το μισό χρόνο που θα ξόδευαν συνήθως για την επικύρωση διαδικασιών και αποτρέπει ακριβά στάδια επανανάπτυξης. Για εκείνους που παράγουν περίπλοκα βιολογικά φάρμακα, εμβόλια ή ακόμη και φυτικά φάρμακα, η δυνατότητα γρήγορης κλιμάκωσης σημαίνει ότι τα προϊόντα φθάνουν στους ασθενείς ταχύτερα, ενώ μειώνονται οι κίνδυνοι κατά την εισαγωγή τους στην αγορά. Γι’ αυτόν τον λόγο, η χρωματογραφία αντίρρευστης ροής έχει καταστεί ένα εξαιρετικά σημαντικό εργαλείο για όσους ασχολούνται σοβαρά με τις σύγχρονες τεχνικές βιοκαθαρισμού.
Η Χρωματογραφία Αντίθετης Ροής (CCC) είναι μια διεργασία διαχωρισμού υγρού-υγρού χωρίς σταθερή φάση, η οποία αποφεύγει προβλήματα όπως η μη αναστρέψιμη προσρόφηση και η απώλεια δείγματος που παρατηρούνται σε μεθόδους με στερεό φέρον.
Η CCC επιτυγχάνει έως και 3000 θεωρητικές πλάκες, ξεπερνώντας τον μέσο όρο των 500 πλακών της τυπικής HPLC, με αποτέλεσμα υψηλότερη ανάλυση και καθαρότερους διαχωρισμούς.
Η CCC χρησιμοποιεί έως και 70% λιγότερους οργανικούς διαλύτες από την προετοιμαστική HPLC, μειώνοντας το κόστος λειτουργίας και την περιβαλλοντική επιβάρυνση μέσω μείωσης του δείκτη E-Factor.
Η CCC αποφεύγει την απώλεια λόγω προσρόφησης και την αναδίπλωση (denaturation), εξαιρώντας τις στερεές φάσεις, διατηρώντας έτσι την ακεραιότητα των βιομορίων και βελτιώνοντας τους ρυθμούς ανάκτησης.
Ναι, η CCC μπορεί να κλιμακωθεί από μικρά εργαστηριακά δείγματα έως μεγάλες βιομηχανικές παρτίδες με ελάχιστη επαναβελτιστοποίηση, καθιστώντας την ιδανική για την παραγωγή φαρμάκων και εμβολίων.
EN
