Az ellenáramú rendszerek hatékonyabban választanak el anyagokat, mivel folyamatos folyadék-folyadék eloszlást alkalmaznak, amely több egyensúlyi fokozatot hoz létre, mint a teoretikus lemezek. Az ilyen rendszerek különlegessége a hagyományos szilárd fázisú módszerekkel szemben az, hogy nem használnak álló támasztóanyagot. Ez azt jelenti, hogy nem merülnek fel olyan problémák, mint a minta komponensek visszafordíthatatlanul történő tapadása a felületekhez, vagy a minta vesztesége a folyamat során. Ehelyett minden elválasztás természetes módon zajlik, kizárólag az egyes vegyületek folyadékok közötti eloszlásán alapul. Az eredmény? Képesek vagyunk egymástól nagyon kevéssé eltérő molekulák – például taxánok vagy különböző flavonoid-formák – megkülönböztetésére, amelyeket máskülönben nehéz lenne elkülöníteni. Az ellenáramú kromatográfia (CCC) általában körülbelül 3000 teoretikus lemezt ér el, ami jóval több, mint amit a szokásos HPLC rendszer általában elér – ez utóbbi legtöbbször legfeljebb 500 lemeznél áll meg. Miért ennyire fontos ez? Mert amikor a fázisok folyamatosan frissülnek, és az anyagcsíkok kevesebbet terjednek szét, sokkal élesebb csúcsokat és tisztább frakciókat kapunk. És a kutatók számára, akik összetett keverékekből próbálják kinyerni az aktív összetevőket, ilyen pontosság nem versenyképes más módszerekkel.
A nagysebességű ellenáramos kromatográfia (HSCCC) módszer jelentős előnyöket mutat a paclitaxel, egy instabil gyógyszerhatóanyag tisztításakor, amelyet óvatos izolációra van szükség. A kutatások szerint az HSCCC technikák segítségével körülbelül 98%-os mennyiségű épségben maradt paclitaxel nyerhető vissza, ami jelentősen meghaladja a hagyományos HPLC módszerek által elérhető 82–85%-os visszanyerési arányt, mivel a vegyületek hajlamosak ragadni és lebomlani a szilícium-dioxid oszlopokon. Amikor a paclitaxel szétválasztásáról van szó hasonló anyagoktól, például a baccatin III-tól és a 10-deacetilbaccatin III-tól, az HSCCC körülbelül 1,5-szer jobb felbontást ér el. Ez főként azért következik be, mert az HSCCC oldatfázisban működik, nem pedig felületi kölcsönhatásokra támaszkodik. Egy további nagy előny, hogy az oldószer-felhasználás körülbelül 60%-kal csökken a hagyományos HPLC eljárásokhoz képest, így az egész folyamat lényegesen költséghatékonyabbá válik. Azoknak a laboroknak, amelyek finom természetes termékekkel dolgoznak, és ahol a molekulák szerkezetének megőrzése a legfontosabb, ezek az eredmények egyértelműen rávilágítanak arra, miért az HSCCC a preferált módszer.
A ellenáramos kromatográfia megőrzi a biomolekulák épségét, mivel teljesen megszünteti azokat a szilárd fázisú határfelületeket. Éppen ezek a határfelületek okozzák általában a problémákat, például a denaturációt, az aggregációt, illetve hogy a molekulák ragadnak és elvesznek. A hagyományos módszerek olyan anyagokra, például szilícium-dioxidra vagy polimer gyantákra támaszkodnak, amelyek hidrofób helyeikkel tulajdonképpen megterhelik a molekulák térbeli szerkezetét. Azonban a folyadék–folyadék elválasztással a fehérjék, az antitestek és a peptidek az egész folyamat során oldott állapotban maradnak. A múlt évben a Nature folyóiratban megjelent kutatás szerint ez a módszer megakadályozza azt az irreverzibilis kibontódást, amely a szilárd fázisú eljárások alkalmazása esetén kb. a terápiás fehérjék 38%-ánál jelentkezik. A visszanyerési arány 25–40%-kal növekszik, és fontos megjegyezni, hogy az enzimek továbbra is megfelelően működnek, valamint az antitestek megtartják antigénekhez való kötőképességüket. Ennek a technikának az egyik legfontosabb előnye, hogy nem igényel magas nyomást, nincsenek benne pórusos anyagok, amelyek eldugulhatnának, és természetesen nincsenek nyíróerők sem, amelyek széttépnék a molekulákat. Ez különösen fontos a nagyon érzékeny biológiai anyagok, például a monoklonális antitestek és különféle peptid hormonok esetében, amelyek egyáltalán nem bírják a durva kezelést.
| Elválasztási módszer | Denaturációs kockázat | Adsorpciós veszteség | Szerkezeti integritás |
|---|---|---|---|
| Szilárd fázis | Magas | 15–30% | Sérült |
| Ellenáramú | Elhanyagolható | <5% | Megvanítva |
A hőérzékeny biomolekulák kezelése során a stabilitás rendkívül fontos. A Journal of Bioprocessing című szakfolyóiratban tavaly megjelent kutatás szerint már rövid ideig tartó, körülbelül 45 °C-os hőmérsékletnek való kitettség is komoly problémákat okozhat, például visszafordíthatatlan aggregációt oszlopos eljárások során. Ezért emelkedik ki a CCC technológia, mivel normál szobahőmérsékleten és nyomáson működik. Ezeknek az előnyöknek köszönhetően számos labor elkezdte átállítani a vakcina-antigének és különféle regeneratív orvoslási alkalmazások tisztítását ellenáramú módszerekre. Ami itt igazán számít, nem csupán az anyagmennyiség, amelyet visszanyernek, hanem az is, hogy a molekulák funkcionális állapotban maradnak-e a feldolgozás után – ez dönti el, hogy az egész művelet sikeres volt-e vagy sem.
Az ellenáramú kromatográfia (CCC) körülbelül 70%-kal csökkenti az organikus oldószerek szükségletét a hagyományos preparatív HPLC-módszerekhez képest. Ez nemcsak az oldószerek beszerzésének költségeiben, hanem azok kezeléséhez és a veszélyes hulladék kezeléséhez szükséges plusz munka költségeiben is jelentős megtakarítást jelent. Az oldószerek felhasználásának csökkenése az úgynevezett környezeti tényezőt (E Factor) körülbelül 24-re csökkenti a CCC-folyamatok esetében – ez lényegesen jobb, mint a szokásos preparatív HPLC-technikák által elérhető 25–100 közötti értéktartomány. Az oldószerek kevesebb használatának további előnyei is vannak: gyorsabb futásidők, kisebb terhelés a berendezések rendszerére, valamint általában simább lefolyás a tisztítási folyamatokban, amelyeket máskülönben gyakran lassítanak a problémás akadályok. Vegyük példaként az ipari méretű növényi kivonatok előállítását: egyes legújabb vizsgálatok szerint – amelyeket a Journal of Chromatography Comparative Analysis című folyóiratban közöltek – amit a preparatív HPLC módszerrel általában 10 liter oldószert igényel, azt a CCC segítségével mindössze 3 liter oldószert használva lehet elvégezni. Mindezek a javulások azt eredményezik, hogy a CCC jól alkalmazható nagyobb méretekben is, anélkül, hogy túlzottan megterhelné a költségvetést, miközben ugyanakkor környezetbarát megoldást is nyújt. És legyünk őszinték: ilyen megközelítés tökéletesen illeszkedik a mai szabályozók elvárásaihoz a gyógyszer- és táplálékkiegészítő-iparban folyó zöld gyártási gyakorlatok tekintetében.
Az ellenáramú rendszerek nagyon egyszerűvé teszik a kis laboratóriumi vizsgálatokról (például 1 mL-es vagy 10 mL-es mintákról) a nagyipari méretű folyamatokra (néha akár 1000 literig) történő skálázást, szinte teljesen elkerülve a beállítások újraoptimalizálásának szükségességét. A titok a mechanizmusban rejlik: a módszer az alapvető eloszlástermodinamikán alapul, nem pedig olyan tényezőkön, mint a kolonna alakja, a töltet sűrűsége vagy az áramlási sebesség hatása a tömegátadásra. Gyakorlati szempontból ez azt jelenti, hogy a kutatók ugyanazokat a oldószereket és áramlási arányokat használhatják, függetlenül attól, hogy kis vagy nagy méretű berendezéssel dolgoznak. Sok labor valóban közvetlenül átviszi a módszereit egy 1 literes készülékről egy 1000 literesre anélkül, hogy bármit is módosítana a fázisarányokon, a forgási sebességeken vagy azokon a gradiensprofilokon, amelyek miatt mindenki annyira izgul. Ez a fajta konzisztencia kb. 50%-kal csökkenti a cégek által általában a folyamatok érvényesítésére fordított időt, és megelőzi a költséges újrafeketési köröket. Azok számára, akik összetett biológiai gyógyszereket, oltóanyagokat vagy akár növényalapú gyógyszereket állítanak elő, a gyors skálázhatóság azt jelenti, hogy a termékek gyorsabban jutnak el a betegekhez, miközben csökken a piacra juttatásuk kockázata. Éppen ezért vált az ellenáramú kromatográfia olyan fontos eszközzé minden olyan szakember számára, aki komolyan veszi a modern biotisztítási technikákat.
Az ellenáramú kromatográfia (CCC) egy folyadék-folyadék elválasztási eljárás, amely nem használ szilárd állófázist, így elkerüli a szilárd hordozókra épülő módszerekben fellépő problémákat, például az irreverzibilis adszorpciót és a mintavesztést.
A CCC akár 3000 elméleti tányért is elér, ami meghaladja a szokásos HPLC átlagos 500 tányérját, így magasabb felbontást és tisztább elválasztásokat eredményez.
A CCC akár 70%-kal kevesebb szerves oldószert használ, mint a preparatív HPLC, csökkentve ezzel az üzemeltetési költségeket és a környezeti terhelést az E-tényező csökkentésével.
A CCC elkerüli a denaturációt és az adszorpciós veszteséget a szilárd hordozók elhagyásával, így megőrzi a biomolekulák szerkezeti integritását és javítja a visszanyerési arányokat.
Igen, a CCC skálázható kis laboratóriumi mintáktól nagy ipari adagokig minimális újraoptimalizálással, így ideális gyógyszer- és oltóanyag-gyártásra.
EN
