Protiprúdne systémy fungujú lepšie pri oddelovaní látok, pretože využívajú spojité kvapalino-kvapalinové rozdeľovanie, ktoré vytvára viacero rovnovážnych stupňov pôsobiacich ako teoretické platňa. To, čo tieto systémy robí špeciálnymi v porovnaní so tradičnými metódami pevnej fázy, je skutočnosť, že neobsahujú žiadne stacionárne nosiče. To znamená, že sa vyhýbame problémom, ako je nevratné priliepanie látok na povrchy alebo straty vzoriek počas procesu. Namiesto toho sa všetko oddeluje prirodzene výlučne na základe toho, ako sa jednotlivé zlúčeniny rozdeľujú medzi kvapalinami. Výsledok? Dokážeme rozlíšiť veľmi podobné molekuly, napríklad taxány alebo rôzne formy flavonoidov, ktoré by inak bolo ťažké od seba odlišiť. Protiprúdna chromatografia (CCC) zvyčajne dosahuje približne 3000 teoretických platní, čo je výrazne viac ako štandardná HPLC, ktorá väčšinou dosahuje najviac približne 500 platní. Prečo je to tak dôležité? Pretože keď sa fázy neustále obnovujú a dochádza k menšiemu rozširovaniu pásom látok, získame oveľa ostrejšie vrcholy a čistejšie frakcie. A pre výskumníkov, ktorí sa snažia izolovať účinné látky z komplikovaných zmesí, táto úroveň presnosti nemá obdobu.
Metóda vysokorýchlostnej protiprúdovej chromatografie (HSCCC) ukazuje jasné výhody pri čistení paclitaxelu, nestabilnej protinádorovej zlúčeniny, ktorú je potrebné opatrne izolovať. Výskum ukazuje, že pomocou techník HSCCC sa dá získať približne 98 % nepoškodeného paclitaxelu, čo je lepšie ako štandardné metódy HPLC, ktoré dosahujú len približne 82 až 85 %, pretože zlúčeniny majú tendenciu sa viazať na kremičitanové stĺpiky a rozkladať sa na nich. Pri oddelení paclitaxelu od podobných látok, ako sú baccatin III a 10-deacetylbaccatin III, dosahuje HSCCC približne 1,5-násobne lepšie rozlíšenie. Toto sa deje hlavne preto, lebo HSCCC pracuje v kvapalnej fáze namiesto toho, aby sa spoliehala na povrchové interakcie. Ďalšou veľkou výhodou je zníženie spotreby rozpúšťadla o približne 60 % v porovnaní s tradičnými procesmi HPLC, čo celú operáciu výrazne zlacňuje. Pre laboratóriá, ktoré pracujú s citlivými prírodnými produktmi, kde je najdôležitejšie zachovať ich štruktúru nepoškodenú, tieto výsledky skutočne zdôrazňujú, prečo sa HSCCC vyznačuje ako preferovaná metóda.
Protiprúdová chromatografia udržiava biomolekuly nedotknuté, pretože úplne odstraňuje pevné fázové rozhrania. Práve tieto rozhrania zvyčajne spôsobujú problémy, ako je denaturácia, agregácia a zachytenie molekúl, čo vedie k ich stratám. Tradičné metódy sa opierajú o materiály, ako je kremičitan alebo polymérne pryskyrky, ktoré obsahujú hydrofóbne miesta, ktoré v skutočnosti spôsobujú napätie a deformáciu tvaru molekúl. Pri kvapalno-kvapalnom rozdeľovaní však proteíny, protilátky a peptidy počas celého procesu zostávajú v roztoku. Podľa výskumu publikovaného v časopise Nature minulý rok táto metóda zabraňuje nezvratnému rozvinutiu, ktoré sa vyskytuje približne u 38 % terapeutických proteínov pri použití pevných fáz. Miera získavania sa zvyšuje o 25 až 40 % a, čo je mimoriadne dôležité, enzýmy stále správne fungujú a protilátky si uchovávajú schopnosť viazať antigény. Táto technika je tak cenná najmä preto, že nepoužíva vysoký tlak, neobsahuje pórovité materiály, ktoré by sa mohli upchať, a určite nevyvoláva strihové sily, ktoré môžu molekuly roztrhnúť. To je veľmi dôležité pre citlivé biologické látky, ako sú monoklonálne protilátky a rôzne peptidové hormóny, ktoré sa veľmi zle vyrovnávajú s mechanickým zaťažením.
| Metóda oddelenia | Riziko denaturácie | Adsorpčné straty | Štrukturálna integrita |
|---|---|---|---|
| Tuho-fázové | Ťahové | 15–30% | Narušené |
| Protiprúdne | Zanedbateľný | <5% | Ukončené |
Stabilita je veľmi dôležitá pri práci s biomolekulami citlivými na teplo. Už krátky kontakt s teplotami okolo 45 °C môže podľa výskumu publikovaného minulý rok v časopise Journal of Bioprocessing spôsobiť vážne problémy, ako napríklad nevratnú agregáciu v procesoch založených na chromatografických stĺpcoch. Preto sa technológia CCC vyznačuje tým, že funguje za bežných podmienok izbovej teploty a tlaku. Vďaka týmto výhodám sa mnoho laboratórií začalo prechádzať na protiprúdne metódy, napríklad pri čistení antigénov vakcín a rôznych aplikáciách regeneratívnej medicíny. Tu rozhodujúca nie je len množstvo získaného materiálu, ale aj to, či tieto molekuly po spracovaní zachovajú svoju funkčnosť – to určuje, či bol celý proces úspešný, alebo nie.
Protiprúdová chromatografia zníži množstvo potrebných organických rozpúšťadiel približne o 70 % v porovnaní s tradičnými prípravnými metódami HPLC. To znamená reálne úspory nielen na nákupu rozpúšťadiel, ale aj na dodatočnej práci spojenej s ich manipuláciou a nakladaním s nebezpečnými odpadmi. Pokles spotreby rozpúšťadiel zníži takzvaný environmentálny faktor (E-faktor) pre procesy protiprúdovej chromatografie na približne 24. To je výrazne lepšie ako bežný rozsah 25 až 100 pozorovaný pri štandardných prípravných metódach HPLC. Použitie menšieho množstva rozpúšťadiel prináša aj ďalšie výhody: zrýchľuje analýzy, zaťažuje menej systémy zariadení a všeobecne odstraňuje tie otravné prekážky pri čistení, ktoré spomaľujú celý proces. Vezmime si napríklad priemyselné extrahovanie rastlinných látok. To, čo by normálne vyžadovalo 10 litrov rozpúšťadla pri prípravnom HPLC, je možné podľa niektorých nedávnych testov uverejnených v časopise Journal of Chromatography Comparative Analysis uskutočniť len s 3 litrami rozpúšťadla pomocou protiprúdovej chromatografie. Všetky tieto zlepšenia znamenajú, že protiprúdová chromatografia dobre funguje aj v väčších mierkach bez nadmerných nákladov a zároveň je ekologicky šetrná. A nech sa páči, tento prístup presne zodpovedá požiadavkám regulátorov v súčasnosti uplatňovaným v oblasti ekologicky šetrných výrobných postupov v farmaceutickom a nutraceutickom priemysle.
Protiprúdne systémy umožňujú veľmi jednoduché zväčšenie mierky od malých laboratórnych testov (napríklad vzoriek o objeme 1 mL alebo 10 mL) až po veľké priemyselné výroby (niekedy až 1 000 litrov), pričom takmer nie je potrebné znovu optimalizovať nastavenia. Táto „mágia“ funguje preto, lebo je založená na základných princípoch termodynamiky rozdeľovania namiesto faktorov, ako je tvar stĺpca, hustota zabalenia fáz alebo rýchlosť prietoku ovplyvňujúca prenos hmoty. V praxi to znamená, že výskumníci môžu používať rovnaké rozpúšťadlá a rovnaké pomery prietokov bez ohľadu na to, či pracujú s malým alebo obrovským vybavením. Mnoho laboratórií dokonca premiestni svoje metódy priamo z 1-litrovej súpravy na 1 000-litrovú bez akýchkoľvek zmien pomerov fáz, rýchlostí rotácie alebo tých gradientných profilov, ktoré všetkých tak zaujímajú. Tento druh konzistencie ušetrí spoločnostiam približne polovicu času, ktorý by inak bežne strávili validáciou procesov, a predchádza drahým kolám opätovného vývoja. Pre výrobcov zložitých biologických liekov, vakcín alebo dokonca rastlinných liečiv znamená táto schopnosť rýchleho zväčšenia mierky skorší prístup produktov k pacientom a zároveň zníženie rizík spojených s ich uvedením na trh. Preto sa protiprúdna chromatografia stala tak dôležitým nástrojom pre každého, kto sa vážne zaoberá modernými technikami biopurifikácie.
Protiprúdová chromatografia (CCC) je kvapalino-kvapalinový separačný proces bez pevnej fázy, ktorý sa vyhýba problémom ako nevratná adsorpcia a straty vzoriek, ktoré sa vyskytujú pri metódach s pevnou nosnou fázou.
CCC dosahuje až 3000 teoretických platní, čím prekonáva priemerných 500 platní štandardnej HPLC a zabezpečuje vyššiu rozlišovaciu schopnosť a čistejšie separácie.
CCC používa až o 70 % menej organických rozpúšťadiel ako preparatívna HPLC, čím zníži prevádzkové náklady a environmentálny dopad prostredníctvom zníženia E-faktora.
CCC sa vyhýba denaturácii a adsorpčným stratám vylúčením pevných nosných látok, čím zachováva integritu biomolekúl a zvyšuje mieru ich získania.
Áno, CCC sa dá škálovať od malých laboratórnych vzoriek až po veľké priemyselné šarže s minimálnou potrebou opätovnej optimalizácie, čo ju robí ideálnou pre výrobu liekov a vakcín.
EN
