Protivtokovi sustavi bolje rade na razdvajanju tvari jer koriste kontinuiranu razdvajanje tekućine na tekućinu, što stvara više stupnjeva ravnoteže koji djeluju kao teorijske ploče. Ono što ove sustave čini posebnima u usporedbi s tradicionalnim metodama čvrste faze jest to što ne uključuju stacionarne podržava. To znači da nemamo problema s stvarima koje se nepromjenjivo vežu za površine ili gubitkom uzoraka tijekom procesa. Umjesto toga, sve se prirodno razdvaja na temelju toga kako se različita spojeva raspoređuju među tekućinama. Što je bilo posljedica? Možemo razlikovati vrlo slične molekule poput taksana ili različitih oblika flavonoida koje bi inače bilo teško razlikovati. Protivna strujna kromatografija ili CCC obično zadovoljava oko 3000 teoretskih ploča, mnogo više od onoga što standardni HPLC upravlja većinu vremena, što se obično zaustavlja na oko 500 ploča maksimalno. Zašto je to toliko važno? Jer kada se faze stalno osvježavaju i manje se šire iz materijalnih pojaseva, na kraju dobijemo mnogo oštrije vrhove i čistije frakcije. I za istraživače koji pokušavaju izvući aktivne sastojke iz kompliciranih mješavina, takva vrsta preciznosti jednostavno nije nadmašljiva.
Metod brze protukončne kromatografije (HSCCC) pokazuje jasne prednosti pri prečišćavanju paklitaksela, nestabilnog antitumorskog jedinjenja koje treba pažljivo izolirati. Istraživanja pokazuju da se oko 98% netaknutog paklitaksela može dobiti pomoću tehnika HSCCC, što je bolje od standardnih HPLC metoda koje se koriste samo oko 82 do 85% jer se spojevi obično vežu i razgrađuju na stupovima silicijeve kiseline. Kada je riječ o razdvajanju paklitaksela od sličnih tvari kao što su bakatin III i 10- deacetilbakatin III, HSCCC postiže otprilike 1, 5 puta bolju rezoluciju. To se događa uglavnom zato što HSCCC radi u fazi otopine, a ne oslanja se na interakcije na površini. Drugi veliki plus je upotreba otapala smanjuje se za oko 60% u usporedbi s tradicionalnim HPLC postupcima, što čini cijelu operaciju mnogo jeftinijom. Za laboratorije koje rade sa osjetljivim prirodnim proizvodima, gdje je održavanje strukture netaknute najvažnije, ovi rezultati istinski naglašavaju zašto se HSCCC ističe kao omiljeni izbor.
Protivtokuća kromatografija održava biomolekule netaknute jer se potpuno riješava onih čvrstih faznih interfejsa. Ovi su interfejsi obično uzrokuju probleme kao što su denaturacija, agregacija, i kada se molekuli zaglave i izgube. Tradicionalne metode se oslanjaju na stvari poput silicijuma ili polimernih smola koje imaju te hidrofobne mrlje koje zapravo naglašavaju oblike molekula. Ali s tečno-tečnoga razdvajanja, proteini, antitela i peptidi ostaju u rastvoru tijekom cijelog procesa. Prema istraživanju objavljenom u časopisu Nature prošle godine, ovaj pristup zaustavlja problem nepovratnog razvoja koji se događa u oko 38% terapeutskih proteina kada se koriste metode čvrste faze. Broj oporavka raste između 25% i 40%, a što je važno, enzimi još uvijek rade ispravno, a antitijela zadržavaju sposobnost vezivanja antigena. Ono što ovu tehniku čini tako vrijednom je to što kroz nju ne prolazi visok pritisak, ne guše se porozni materijali i definitivno ne postoje sile sušenja koje razdvajaju stvari. To je jako važno za osjetljive biološke tvari kao što su monoklonska antitijela i različiti peptidni hormoni koji jednostavno ne mogu dobro nositi grubo rukovanje.
| Metod za odvajanje | Rizici od denaturacije | Izgubi adsorpcije | Strukturna čvrstoća |
|---|---|---|---|
| Složeni-fazni | Visoko | 15–30% | Kompromisno |
| Protivtok | Zanemarivo | <5% | Sačuvano |
Stabilnost je važna kada se radi o biomolekulama osjetljivim na toplinu. Samo kratak kontakt s temperaturama oko 45 stupnjeva Celzijusa može uzrokovati ozbiljne probleme poput nepovratne agregacije u procesima na bazi stupca prema istraživanju objavljenom u časopisu Journal of Bioprocessing prošle godine. Zato se CCC tehnologija ističe jer radi na normalnom sobnom pritisku i temperaturnim uvjetima. Zbog tih prednosti, mnoge laboratorije su počele prelaziti na protivna trenutna metoda za stvari poput pročišćavanja cjepiva antigena i raznih aplikacija regenerativne medicine. Ono što je važno ovdje nije samo koliko materijala se oporavi, već da li će ti molekuli ostati funkcionalni nakon obrade što određuje je li cijela operacija uspješna ili ne.
Protivtokenska hromatografija smanjuje potreban broj organskih rastvarača za oko 70% u usporedbi s tradicionalnim metodama pripreme HPLC. To znači da se ne samo uštede novac na kupnji rastvarača nego i na dodatnom radu koji se vrši prilikom njihovog rukovanja i obrade opasnih otpada. Smanjenje upotrebe rastvarača smanjuje ono što kemičari nazivaju faktorom okoliša ili E faktorom na oko 24 za CCC procese. To je puno bolje od uobičajenog raspona od 25 do 100 vidjena sa standardnim priprema HPLC tehnike. Upotreba manje rastvarača ima i druge prednosti: brže se vozi, manje se naplaćuje oprema i uglavnom se izblažavaju one dosadne prepreke čišćenja koje usporavaju rad. Uzmimo kao primjer industrijsku botaničku ekstrakciju. Ono što bi obično trajalo 10 litara rastvarača s HPLC-om može se učiniti samo s 3 litara CCC-a prema nedavnim testovima u časopisu Journal of Chromatography Comparative Analysis. Sve to poboljšanja znači da CCC dobro radi u većim razmjerima bez razbijanja banke, a istovremeno je dobar za okoliš. I budimo iskreni, takav pristup se uklapa u ono što regulatorni organi danas traže u zelenoj proizvodnji u farmaceutskoj i nutraceutical industriji.
Protivtokovni sustavi čine povećanje od malih laboratorijskih testova (kao što su 1 ml ili 10 ml uzorci) sve do velikih industrijskih trka (ponekad i do 1.000 litara) prilično jednostavnim, bez potrebe za ponovnim prilagođavanjem stvari. Čarolija se događa jer se temelji na osnovnoj termodinamiki podjele umjesto stvari poput oblika stupca, kako je sve čvrsto pakirano, ili brzine protoka koje utječu na prijenos mase. To u praksi znači da istraživači mogu koristiti iste rastvarače i razmjere protoka bez obzira na to rade li s malom ili velikom opremom. Mnoge laboratorije zapravo prebace svoje metode izravno iz 1 litar postavke na 1000 litar jedan bez promjene ništa o razlozi faza, brzine rotacije, ili one gradijent profile svi su tako uznemireni oko. Takva dosljednost štedi tvrtkama oko polovice vremena koje bi obično potrošile na provjeru procesa i izbjegava skupe runde preuređenja. Za ljude koji proizvode složene biološke lijekove, cjepiva, ili čak biljne lijekove, ova sposobnost brzog razmjeravanja znači brže dostavljanje proizvoda pacijentima dok se smanjuju rizici prilikom njihovog uvođenja na tržište. Zato je kromatografija protiv struje postala tako važno sredstvo za svakoga tko ozbiljno razmišlja o modernim tehnikama biopurifikacije.
Protivtrenska hromatografija (CCC) je proces odvajanja tekućine od tekućine bez stacionarne faze, što izbjegava probleme poput nepovratne adsorpcije i gubitka uzorka koji se vide u metodama čvrste podloge.
CCC postiže do 3000 teorijskih ploča, premašujući prosječne 500 ploča standardnog HPLC-a, što rezultira većom rezolucijom i čistijim odvajanjem.
U skladu s člankom 3. stavkom 1. točkom (a) Uredbe (EZ) br. 1272/2008 Komisija je odlučila da se za CCC-a primjenjuje sljedeći sustav:
CCC izbjegava denaturaciju i adsorpcijski gubitak eliminiranjem čvrstih podloga, očuvanjem biomolekularnog integriteta i poboljšanjem stope oporavka.
Da, CCC može se razmjeriti od malih laboratorijskih uzoraka do velikih industrijskih serija uz minimalnu re-optimizaciju, što ga čini idealnim za proizvodnju lijekova i cjepiva.
EN
