Protiproudé systémy pracují efektivněji při oddělování látek, protože využívají spojité kapalina-kapalina rozdělování, které vytváří několik rovnovážných stupňů působících jako teoretické desky. To, co tyto systémy odlišuje od tradičních metod s pevnou fází, je absence jakýchkoli nepohyblivých nosičů. To znamená, že se vyhýbáme problémům spojeným s nevratným přilnaváním látek na povrchy nebo ztrátou vzorků během procesu. Místo toho se vše odděluje přirozeně pouze na základě toho, jak se jednotlivé sloučeniny rozdělují mezi kapalné fáze. Výsledek? Dokážeme rozlišit velmi podobné molekuly, například taxany nebo různé formy flavonoidů, které by jinak bylo obtížné od sebe odlišit. Protiproudá chromatografie (CCC) obvykle dosahuje přibližně 3000 teoretických desek – mnohem více než standardní HPLC, která většinou nepřesáhne maximálně 500 desek. Proč je to tak důležité? Protože když se fáze neustále obnovují a dochází k menšímu rozptylu pásů látek, vznikají ostřejší špičky a čistější frakce. A pro výzkumníky, kteří se snaží izolovat účinné složky ze složitých směsí, tato přesnost prostě nemá obdoby.
Metoda vysokorychlostní protiproudní chromatografie (HSCCC) ukazuje jasné výhody při čištění paclitaxelu, nestabilního protinádorového sloučeniny, který vyžaduje opatrné izolování. Výzkum ukazuje, že pomocí technik HSCCC lze získat přibližně 98 % nepoškozeného paclitaxelu, což převyšuje standardní metody HPLC, které dosahují pouze přibližně 82 až 85 %, neboť sloučeniny mají tendenci se zachycovat na křemičitanových sloupcích a na nich se rozkládat. Při oddělování paclitaxelu od podobných látek, jako jsou baccatin III a 10-deacetylbaccatin III, dosahuje HSCCC přibližně 1,5krát lepší rozlišení. K tomu dochází především proto, že HSCCC pracuje ve fázi roztoku, nikoli na základě povrchových interakcí. Další velkou výhodou je snížení spotřeby rozpouštědel o přibližně 60 % oproti tradičním procesům HPLC, čímž se celý postup stává mnohem nákladově efektivnějším. Pro laboratoře zabývající se citlivými přírodními produkty, u nichž je nejdůležitější zachování jejich struktury, tyto výsledky skutečně zdůrazňují, proč je HSCCC preferovanou metodou volby.
Kontroprůtoková chromatografie uchovává biomolekuly nepoškozené, protože zcela eliminuje pevné fáze rozhraní. Právě tato rozhraní obvykle způsobují problémy, jako je denaturace, agregace nebo zachycení a ztráta molekul. Tradiční metody spoléhají na materiály, jako je křemelina nebo polymerové pryskyřice, které obsahují hydrofobní místa, jež skutečně narušují prostorovou strukturu molekul. Naopak při kapalino-kapalinovém rozdělování zůstávají proteiny, protilátky a peptidy po celou dobu procesu ve vodném roztoku. Podle výzkumu publikovaného v časopisu Nature minulý rok tato metoda zabrání nevratnému rozvinutí, ke kterému dochází přibližně u 38 % terapeutických proteinů při použití metod s pevnou fází. Výtěžnost se zvyšuje o 25 až 40 % a důležité je, že enzymy zachovávají svou aktivitu a protilátky si udržují schopnost vázat antigeny. Tato technika je tak cenná zejména proto, že nepoužívá vysoký tlak, neobsahuje pórovité materiály, které by se mohly ucpat, a rozhodně nevytváří smykové síly, jež by molekuly poškozovaly. To je zásadní pro citlivé biologické látky, jako jsou monoklonální protilátky a různé peptidové hormony, které se velmi špatně vyrovnávají s mechanickým namáháním.
| Metoda oddělení | Riziko denaturace | Adsorpční ztráty | Strukturální integrita |
|---|---|---|---|
| Pevná fáze | Vysoká | 15–30% | Narušeno |
| Protiproudý | Zanedbatelné | <5% | Přežit |
Stabilita je zásadní při zacházení s tepelně citlivými biomolekulami. Již krátký kontakt s teplotami kolem 45 °C může podle výzkumu publikovaného minulý rok v Journal of Bioprocessing způsobit vážné problémy, jako je například nevratná agregace v procesech založených na chromatografických kolonách. Proto se technologie CCC vyznačuje tím, že funguje za normálních podmínek pokojového tlaku a teploty. Díky těmto výhodám začaly mnohé laboratoře přecházet na protiproudé metody například pro čištění antigenních složek vakcín a různé aplikace regenerativní medicíny. Zde rozhodující není pouze množství získaného materiálu, ale především to, zda zůstávají molekuly po zpracování funkční – a právě to rozhoduje o úspěšnosti celého procesu.
Protiproudá chromatografie snižuje množství organických rozpouštědel potřebných přibližně o 70 % ve srovnání s tradičními preparativními HPLC metodami. To znamená skutečné úspory – nejen na nákupu rozpouštědel, ale také na veškeré dodatečné práci spojené s jejich manipulací a nakládáním s nebezpečnými odpady. Snížení spotřeby rozpouštědel snižuje tzv. environmentální faktor (E-factor) pro CCC procesy na přibližně 24. To je výrazně lepší než běžný rozsah 25 až 100 u standardních preparativních HPLC technik. Snížená spotřeba rozpouštědel má i další výhody: zrychluje analýzy, zmenšuje zátěž na zařízení a obecně odstraňuje obtížné překážky při čištění, které zpomalují celý proces. Jako příklad lze uvést průmyslové extrakce rostlinných látek. Zatímco při preparativní HPLC by se obvykle vyžadovalo 10 litrů rozpouštědla, podle nedávných testů publikovaných v časopisu Journal of Chromatography: Comparative Analysis stačí při CCC pouze 3 litry. Všechny tyto vylepšení znamenají, že CCC dobře funguje i v rozsáhlejším měřítku, aniž by to vedlo k nadměrným nákladům, a zároveň je šetrná k životnímu prostředí. A upřímně řečeno, tento přístup plně odpovídá požadavkům regulativních orgánů na zelené výrobní postupy v farmaceutickém a nutraceutickém průmyslu.
Protiproudé systémy umožňují velmi přímou a snadnou škálovatelnost od malých laboratorních testů (např. vzorky o objemu 1 ml nebo 10 ml) až po rozsáhlé průmyslové provozy (někdy až 1 000 litrů), přičemž téměř není nutné provádět další úpravy. Klíčovým faktorem je zde základní termodynamika rozdělení, nikoli parametry jako tvar kolony, stupeň jejího zhuštění nebo rychlost toku ovlivňující přenos hmoty. V praxi to znamená, že výzkumníci mohou používat stejné rozpouštědla a stejné poměry toku bez ohledu na to, zda pracují s malým či obrovským zařízením. Mnoho laboratoří dokonce převádí své metody přímo z nastavení o objemu 1 litr na zařízení o objemu 1 000 litrů, aniž by změnilo poměry fází, otáčky nebo ty profilové gradienty, kvůli nimž se všichni tak nadšeně rozčilují. Tato konzistence ušetří firmám přibližně polovinu času, který by jinak strávily validací procesů, a zabrání nákladným cyklům opětovného vývoje. Pro výrobce složitých biologických léčiv, vakcín či dokonce rostlinných léčiv znamená tato rychlá škálovatelnost rychlejší dodání produktů pacientům a současně snížení rizik spojených s jejich uvedením na trh. Proto se protiproudá chromatografie stala tak důležitým nástrojem pro každého, kdo se vážně zajímá o moderní techniky biopurifikace.
Protiproudá chromatografie (CCC) je kapalino-kapalinový separační proces bez pevné fáze, který eliminuje problémy jako nevratná adsorpce a ztráta vzorku, jež se vyskytují u metod s pevným nosičem.
CCC dosahuje až 3000 teoretických tácel, což překračuje průměrných 500 tácel standardní HPLC a vede k vyšší rozlišovací schopnosti a čistějším separacím.
CCC využívá až o 70 % méně organických rozpouštědel než preparativní HPLC, čímž snižuje provozní náklady i environmentální dopad prostřednictvím snížení E-faktoru.
CCC zabrání denaturaci a adsorpční ztrátě tím, že eliminuje pevné nosiče, čímž zachovává integritu biomolekul a zvyšuje výtěžnost.
Ano, CCC lze škálovat od malých laboratorních vzorků až po velké průmyslové šarže s minimální nutností opětovné optimalizace, což ji činí ideální pro výrobu léčiv a vakcín.
EN
