Systemy przepływu przeciwnego działają lepiej w rozdzielaniu substancji, ponieważ wykorzystują ciągłe rozdział ciecz–ciecz, tworząc wiele etapów równowagi działających jak płytki teoretyczne. To, co czyni te systemy wyjątkowymi w porównaniu z tradycyjnymi metodami faz stałych, to brak nośników nieruchomych. Oznacza to, że nie występują problemy związane z nieodwracalnym przywieraniem substancji do powierzchni ani utratą próbek w trakcie procesu. Zamiast tego całe rozdzielenie przebiega naturalnie wyłącznie na podstawie różnic w rozkładzie poszczególnych związków między fazami ciekłymi. Wynik? Możemy skutecznie rozróżnić bardzo podobne molekuły, takie jak taksany czy różne formy flawonoidów, które w innych warunkach trudno byłoby od siebie odróżnić. Chromatografia przepływu przeciwnego (CCC) osiąga zwykle około 3000 płytek teoretycznych – znacznie więcej niż standardowa chromatografia cieczowa wysokiego ciśnienia (HPLC), która najczęściej nie przekracza 500 płytek. Dlaczego jest to tak istotne? Ponieważ przy ciągłym odświeżaniu faz i mniejszym rozmywaniu pasm substancji uzyskujemy znacznie bardziej ostre szczyty oraz czystsze frakcje. A dla badaczy próbujących wyizolować składniki aktywne z złożonych mieszanin taka precyzja jest po prostu nieosiągalna innymi metodami.
Metoda wysokoprzepływowej chromatografii przeciwbieżnej (HSCCC) wykazuje wyraźne zalety przy oczyszczaniu paklitakselu, niestabilnego związku przeciwnowotworowego, który wymaga ostrożnego izolowania. Badania wskazują, że za pomocą technik HSCCC można odzyskać około 98% nietkniętego paklitakselu, co jest lepszym wynikiem niż uzyskiwany w standardowych metodach HPLC (około 82–85%), ponieważ związki te mają tendencję do przywierania do kolumn krzemionkowych i ulegania na nich degradacji. W przypadku rozdzielania paklitakselu od podobnych związków, takich jak bakatyna III i 10-deacetylobakatyna III, HSCCC zapewnia rozdzielczość około 1,5 raza wyższą. Dzieje się tak głównie dlatego, że HSCCC przebiega w fazie ciekłej, a nie opiera się na oddziaływaniach powierzchniowych. Inną ważną zaletą jest obniżenie zużycia rozpuszczalników o około 60% w porównaniu do tradycyjnych procesów HPLC, co czyni całą operację znacznie bardziej opłacalną. Dla laboratoriów pracujących z delikatnymi produktami naturalnymi, u których najważniejsze jest zachowanie integralności strukturalnej, te wyniki rzeczywiście podkreślają, dlaczego HSCCC wyróżnia się jako metoda preferowana.
Chromatografia przeciwpłynowa zachowuje biomolekuły w niezmienionej postaci, ponieważ całkowicie eliminuje stałe fazy interfejsowe. To właśnie te interfejsy zazwyczaj powodują problemy takie jak denaturacja, agregacja oraz przywieranie i utrata cząsteczek. Tradycyjne metody opierają się na materiałach takich jak krzemionka lub żywice polimerowe, które zawierają hydrofobowe miejsca – a te właśnie miejsca wywołują naprężenie kształtu cząsteczek. Natomiast przy rozdziałach opartych na partycji ciecz–ciecz białka, przeciwciała oraz peptydy pozostają cały czas w roztworze. Zgodnie z badaniami opublikowanymi w czasopiśmie „Nature” w zeszłym roku, podejście to zapobiega nieodwracalnemu rozwijaniu się cząsteczek, które występuje u około 38% terapeutycznych białek przy zastosowaniu metod z udziałem stałej fazy. Współczynniki odzysku wzrastają o 25–40%, a co istotne, enzymy zachowują pełną aktywność, a przeciwciała utrzymują zdolność wiązania antygenów. Kluczową zaletą tej techniki jest brak wysokiego ciśnienia, brak materiałów porowatych, które mogłyby się zatkować, oraz – co najważniejsze – brak sił ścinających, które niszczą cząsteczki. Ma to szczególne znaczenie dla wrażliwych substancji biologicznych, takich jak monoklonalne przeciwciała czy różne hormony peptydowe, które bardzo źle tolerują intensywne oddziaływania mechaniczne.
| Metoda rozdziału | Ryzyko denaturacji | Utrata przez adsorpcję | Integralność strukturalną |
|---|---|---|---|
| Faza stała | Wysoki | 15–30% | Naruszone |
| Przeciwprądowa | Pomijalne | <5% | Zachowane |
Stabilność ma ogromne znaczenie przy obróbce biomolekuł wrażliwych na ciepło. Zgodnie z badaniami opublikowanymi w zeszłorocznym wydaniu Journal of Bioprocessing, nawet krótki kontakt z temperaturami około 45 stopni Celsjusza może powodować poważne problemy, takie jak nieodwracalna agregacja w procesach opartych na kolumnach. Dlatego technologia CCC wyróżnia się na tle innych rozwiązań – działa w normalnych warunkach ciśnienia i temperatury pokojowej. Dzięki tym zaletom wiele laboratoriów zaczęło przechodzić na metody przeciwprądowe do czyszczenia antygenów szczepionkowych oraz w różnych zastosowaniach medycyny regeneracyjnej. Kluczowe w tym przypadku nie jest jedynie ilość odzyskanego materiału, lecz przede wszystkim zachowanie funkcjonalności tych cząsteczek po przetworzeniu – to właśnie decyduje o ogólnym sukcesie całej operacji.
Chromatografia przeciwnoprądowa (CCC) zmniejsza zużycie rozpuszczalników organicznych o około 70% w porównaniu do tradycyjnych metod przygotowawczej chromatografii cieczowej wysokiego ciśnienia (prep HPLC). Oznacza to rzeczywiste oszczędności nie tylko na zakupie rozpuszczalników, ale także na dodatkowej pracy związanej z ich obsługą oraz z utylizacją odpadów niebezpiecznych. Spadek zużycia rozpuszczalników obniża tzw. współczynnik środowiskowy (E Factor) do około 24 dla procesów CCC – wartość znacznie lepsza niż typowy zakres od 25 do 100 obserwowany przy standardowych technikach prep HPLC. Zmniejszone zużycie rozpuszczalników ma również inne zalety: skraca czas analizy, zmniejsza obciążenie systemów sprzętowych oraz ogólnie ułatwia przezwyciężanie tych uciążliwych barier oczyszczania, które spowalniają całe procesy. Weźmy na przykład ekstrakcję botaniczną w skali przemysłowej: zgodnie z niektórymi najnowszymi badaniami opublikowanymi w „Journal of Chromatography Comparative Analysis”, ilość rozpuszczalnika potrzebnego do wykonania tej operacji można zmniejszyć z 10 litrów (w przypadku prep HPLC) do zaledwie 3 litrów przy zastosowaniu CCC. Wszystkie te usprawnienia sprawiają, że CCC nadaje się do zastosowania w większych skalach bez nadmiernych kosztów, zachowując przy tym korzyści dla środowiska. A przecież tego rodzaju podejście idealnie wpisuje się w obecne oczekiwania organów regulacyjnych w zakresie zielonych praktyk produkcyjnych w branżach farmaceutycznej i nutraceutyków.
Systemy przepływu przeciwnego umożliwiają łatwe skalowanie w górę – od małych badań laboratoryjnych (np. próbek o objętości 1 mL lub 10 mL) aż po duże procesy przemysłowe (czasem nawet do 1000 litrów), przy praktycznie braku konieczności ponownej dopasowywania parametrów. Kluczowym czynnikiem jest tu zastosowanie podstawowych zasad termodynamiki rozdziału, a nie takich czynników jak kształt kolumny, stopień zagęszczenia wypełnienia czy wpływ prędkości przepływu na przenoszenie masy. W praktyce oznacza to, że badacze mogą stosować te same rozpuszczalniki i te same proporcje przepływu niezależnie od tego, czy pracują na małych, czy na bardzo dużych urządzeniach. Wiele laboratoriów przenosi swoje metody bezpośrednio z układu o pojemności 1 litra na układ o pojemności 1000 litrów, bez zmiany proporcji faz, prędkości obrotowej ani profili gradientu – tych elementów, które zwykle budzą największe zainteresowanie i dyskusje. Taka spójność pozwala firmom zaoszczędzić około połowę czasu normalnie potrzebnego na walidację procesów oraz uniknąć kosztownych etapów ponownego opracowywania metod. Dla producentów złożonych leków biologicznych, szczepionek czy nawet leków pochodzenia roślinnego zdolność szybkiego skalowania oznacza szybsze dostarczanie produktów do pacjentów oraz ograniczenie ryzyka związanych z ich wprowadzaniem na rynek. Dlatego chromatografia przepływu przeciwnego stała się tak ważnym narzędziem dla wszystkich, którzy poważnie traktują nowoczesne techniki biopurifikacji.
Chromatografia przeciwpływowa (CCC) to proces separacji ciecz–ciecz bez fazy stałej, który unika problemów takich jak nieodwracalne adsorpcja i utrata próbek występujących w metodach wykorzystujących nośniki stałe.
CCC osiąga do 3000 płytek teoretycznych, przewyższając średnią wartość 500 płytek standardowej chromatografii cieczowej wysokiego ciśnienia (HPLC), co przekłada się na wyższą rozdzielczość i czystsze separacje.
CCC zużywa nawet o 70% mniej rozpuszczalników organicznych niż preparatywna HPLC, obniżając koszty operacyjne oraz wpływ na środowisko poprzez redukcję współczynnika E (E-Factor).
CCC unika denaturacji i utraty przez adsorpcję dzięki eliminacji nośników stałych, zachowując integralność biomolekuł oraz poprawiając wskaźniki ich odzysku.
Tak, CCC może być skalowana od małych próbek laboratoryjnych po duże partie przemysłowe przy minimalnej konieczności ponownej optymalizacji, co czyni ją idealną do produkcji leków i szczepionek.
EN
