Ang mga sistemang counter current ay gumagana nang mas mainam sa paghihiwalay ng mga sangkap dahil ginagamit nila ang patuloy na likido-sa-likidong partitioning, na lumilikha ng maraming yugto ng equilibrium na kumikilos tulad ng mga teoretikal na plato. Ang kakaiba ng mga sistemang ito kumpara sa tradisyonal na mga paraan na may solid phase ay wala silang mga stationary na suporta. Ibig sabihin, hindi tayo nakakaranas ng mga problema tulad ng pagkakadikit ng mga bagay sa mga ibabaw nang di-maaibalik o pagkawala ng mga sample sa proseso. Sa halip, ang lahat ay hihiwalayin nang natural batay lamang sa paraan kung paano ipinamamahagi ng iba't ibang mga compound ang kanilang sarili sa pagitan ng mga likido. Ano ang resulta? Kakayahang ihiwalay ang mga napakakatulad na molekula tulad ng taxanes o iba't ibang anyo ng flavonoid na kung hindi man ay mahirap paghiwalayin. Ang Counter Current Chromatography o CCC ay karaniwang umaabot sa humigit-kumulang 3000 teoretikal na plato, na malaki ang agwat kumpara sa karaniwang maisasagawa ng standard na HPLC—na kadalasan ay tumitigil sa humigit-kumulang 500 plato lamang. Bakit ito lubhang mahalaga? Dahil kapag patuloy na binabago ang mga phase at mas kaunti ang pagkalat ng mga band ng sangkap, nagreresulta ito sa mas matutulis na mga peak at mas malinis na mga fraction. At para sa mga mananaliksik na sinusubukang kunin ang mga aktibong sangkap mula sa mga kumplikadong halo, ang ganitong antas ng katiyakan ay walang katumbas.
Ang paraan ng High-Speed Countercurrent Chromatography (HSCCC) ay nagpapakita ng malinaw na mga pakinabang kapag ginagamit sa pagpapalinis ng paclitaxel, isang hindi matatag na anti-kanser na sangkap na nangangailangan ng maingat na paghihiwalay. Ang pananaliksik ay nagpapahiwatig na humigit-kumulang sa 98% ng buong paclitaxel ay maaaring mabawi gamit ang mga teknik ng HSCCC—na mas mataas kaysa sa karaniwang mga paraan ng HPLC na nakakakuha lamang ng humigit-kumulang sa 82 hanggang 85% dahil ang mga sangkap ay madalas na dumikit at nababaguhang pisikal sa mga kulay-silica na haligi. Sa paghihiwalay ng paclitaxel mula sa mga katulad na sangkap tulad ng baccatin III at 10-deacetylbaccatin III, ang HSCCC ay nakakamit ng humigit-kumulang sa 1.5 beses na mas mataas na resolusyon. Ito ay nangyayari pangunahin dahil ang HSCCC ay gumagana sa yugto ng solusyon imbes na umaasa sa mga interaksyon sa ibabaw. Isa pang malaking kapakinabangan ay ang paggamit ng solvent ay bumababa ng humigit-kumulang sa 60% kumpara sa tradisyonal na mga proseso ng HPLC, na ginagawa ang kabuuang operasyon na lubos na mas epektibo sa gastos. Para sa mga laboratorio na gumagawa ng delikadong natural na produkto kung saan ang pangunahing prayoridad ay ang pagpanatili ng buong istruktura nito, ang mga resultang ito ay tunay na nagpapakita kung bakit ang HSCCC ay naninirahan bilang piniling pamamaraan.
Ang counter current chromatography ay nagpapanatili ng integridad ng mga biomolekula dahil ito ay ganap na nagtatanggal ng mga solid phase interface. Ang mga interface na ito ang karaniwang sanhi ng mga problema tulad ng denaturation, aggregation, at kung saan ang mga molekula ay nakakalagay at nawawala. Ang mga tradisyonal na pamamaraan ay umaasa sa mga bagay tulad ng silica o polymer resins na may mga hydrophobic na lugar na talagang nagdudulot ng stress sa hugis ng mga molekula. Ngunit sa pamamagitan ng liquid-liquid partitioning, ang mga protein, antibody, at peptide ay nananatiling nasa solusyon sa buong proseso. Ayon sa pananaliksik na inilathala sa Nature noong nakaraang taon, ang pamamaraang ito ay nakakapigil sa hindi mababalik na pag-unfold na nararanasan ng mga therapeutic protein sa halos 38% ng mga kaso kapag ginagamit ang mga solid phase method. Ang mga rate ng recovery ay tumataas sa pagitan ng 25% at 40%, at mahalaga, ang mga enzyme ay nananatiling aktibo at ang mga antibody ay pinapanatili ang kanilang kakayahang mag-bind sa mga antigen. Ang nagpapahalaga sa teknik na ito ay ang kawalan ng mataas na presyon na dumadaloy dito, ang kawalan ng porous na materyales na maaaring mag-clog, at tiyak na walang shear forces na pumuputol o sumisira sa mga molekula. Mahalaga ito lalo na para sa mga sensitibong biologicals tulad ng monoclonal antibodies at iba’t ibang peptide hormone na hindi gaanong kayang iproseso sa malupit o masyadong agresibong kondisyon.
| Paraan ng Paghiihiwalay | Panganib ng Denaturasyon | Kawalan sa Pamamagitan ng Adsorpsyon | Integridad ng Estruktura |
|---|---|---|---|
| Solid-phase | Mataas | 15–30% | Nakompromiso |
| Counter-current | Hindi gaanong Mahalaga | <5% | Inaasahan |
Ang katatagan ay napakahalaga kapag hinahandle ang mga biomolekula na sensitibo sa init. Ayon sa isang pag-aaral na inilathala noong nakaraang taon sa Journal of Bioprocessing, kahit ang maikling kontak sa temperatura na humigit-kumulang sa 45°C ay maaaring magdulot ng malubhang problema tulad ng di-maibalik na aglomerasyon sa mga proseso na gumagamit ng column. Dahil dito, nagtatangi ang CCC technology dahil ito ay gumagana sa normal na presyon at temperatura ng silid. Dahil sa mga pakinabang na ito, maraming laboratorio ang nagsimulang lumipat sa mga paraan ng counter current para sa mga gawain tulad ng pagpapalinis ng mga antigen ng bakuna at iba’t ibang aplikasyon sa regenerative medicine. Ang tunay na mahalaga rito ay hindi lamang kung gaano karami ang matutunghayan na materyal, kundi kung ang mga molekula ay nananatiling may kakayahang gumana pagkatapos ng proseso—ito ang tumutukoy kung matagumpay ba o hindi ang buong operasyon.
Ang counter current chromatography ay nagpapababa ng paggamit ng organikong solvent ng mga 70% kumpara sa tradisyonal na mga paraan ng preparatory HPLC. Ito ay nangangahulugan ng tunay na pagtitipid—hindi lamang sa pagbili ng mga solvent kundi pati na rin sa lahat ng karagdagang gawain na kailangan sa paghawak sa kanila at sa pagharap sa nakapipinsalang basura. Ang pagbaba ng paggamit ng solvent ay nagpapababa rin ng tinatawag na environmental factor o E Factor—na umaabot sa humigit-kumulang 24 para sa mga proseso ng CCC—na malaki ang pagkakaiba kumpara sa karaniwang saklaw na 25 hanggang 100 sa mga karaniwang teknik ng preparatory HPLC. Bukod dito, ang mas kaunting paggamit ng solvent ay may iba pang pakinabang: mas mabilis na pagpapatakbo, mas kaunting stress sa mga kagamitan at sistema, at pangkalahatan ay nagpapaginhawa sa mga nakakainis na balakid sa pagpapalinis na kadalasang nagpapabagal ng proseso. Halimbawa, sa industriyal na antas ng botanical extraction, ang isang proseso na kailangang gumamit ng 10 litro ng solvent sa preparatory HPLC ay maaaring gawin na lamang gamit ang 3 litro gamit ang CCC, ayon sa ilang kamakailang pagsusuri sa Journal of Chromatography Comparative Analysis. Lahat ng mga pagpapabuti na ito ay nangangahulugan na ang CCC ay epektibo rin sa mas malalaking antas ng produksyon nang hindi lumalabag sa badyet, habang nananatiling kapaki-pakinabang para sa kapaligiran. At walang duda, ang ganitong uri ng pamamaraan ay sumasang-ayon talaga sa mga inaasahan ng mga regulador sa kasalukuyang panahon tungkol sa mga green manufacturing practice sa mga industriya ng pharmaceutical at nutraceutical.
Ang mga sistemang counter current ay nagpapaginhawa sa pagpapalawak mula sa maliit na pagsusuri sa laboratorio (tulad ng mga sample na 1 mL o 10 mL) hanggang sa malalaking operasyon sa industriya (na minsan ay umaabot sa 1,000 litro), na halos walang kailangang pag-aadjust uli. Ang 'kagila-gilalas' na ito ay nangyayari dahil batay ito sa pangunahing thermodynamics ng partition, imbes na sa mga salik tulad ng hugis ng column, kung gaano katiyak ang pagkakapit ng lahat ng bagay, o sa mga rate ng daloy na nakaaapekto sa mass transfer. Ang ibig sabihin nito sa praktikal na aplikasyon ay ang mga mananaliksik ay maaaring gamitin ang parehong mga solvent at mga ratio ng daloy anuman ang laki ng kanilang kagamitan—maliit man o napakalaki. Maraming laboratorio ang direktang isinasalin ang kanilang mga pamamaraan mula sa setup na 1 litro papuntang setup na 1,000 litro nang walang anumang pagbabago sa mga ratio ng phase, bilis ng pag-ikot, o sa mga gradient profile na kadalasang pinag-uusapan at pinagkakabahalaan ng lahat. Ang ganitong uri ng pagkakasunod-sunod ay nakakatipid ng halos kalahating oras na karaniwang ginugugol ng mga kumpanya sa pagpapatunay ng mga proseso at nag-iwas sa mahal na mga yugto ng muling pag-unlad. Para sa mga gumagawa ng kumplikadong biological na gamot, bakuna, o kahit na mga gamot na galing sa halaman, ang kakayahang ito na mapabilis ang pagpapalawak ay nangangahulugan ng mas mabilis na pagkakaroon ng mga produkto sa mga pasyente habang binabawasan ang mga panganib sa pagpapakilala nito sa merkado. Kaya nga ang counter current chromatography ay naging isang napakahalagang kasangkapan para sa sinumang seryoso sa mga modernong teknik ng biopurification.
Ang Counter Current Chromatography (CCC) ay isang proseso ng paghihiwalay ng likido-mula-sa-likido na walang stationary phase, kaya’t ito ay nag-iilavoid ng mga problema tulad ng di-pabalik na adsorption at pagkawala ng sample na karaniwang nakikita sa mga paraan na gumagamit ng solid support.
Ang CCC ay nakakamit hanggang 3000 theoretical plates, na lumalampas sa karaniwang 500 plates ng standard na HPLC, na nagreresulta sa mas mataas na resolusyon at mas malinis na paghihiwalay.
Gumagamit ang CCC ng hanggang 70% na mas kaunti ng organic solvents kaysa sa prep-HPLC, na bumababa sa operasyonal na gastos at sa epekto nito sa kapaligiran sa pamamagitan ng pagbawas sa E-Factor.
Ang CCC ay nag-iilavoid ng denaturation at adsorptive loss sa pamamagitan ng pag-alis ng solid supports, na pinapanatili ang integridad ng biomolecule at nagpapabuti ng mga rate ng recovery.
Oo, maaaring i-scale ang CCC mula sa maliit na sample sa laboratorio hanggang sa malalaking industriyal na batch na may kaunting re-optimization lamang, kaya ito ay perpektong angkop para sa produksyon ng gamot at bakuna.
EN
