מערכות זרימה נגדית פועלות טוב יותר בנפרדת חומרים מכיוון שהן משתמשות בחלוקה רציפה של נוזל-בנוזל, מה שמייצר מספר שלבים של שיווי משקל הפועלים כצלחות תיאורטיות. מה שמייחד מערכות אלו לעומת שיטות מסורתיות של פאזה מוצקה הוא שאין בהם תמיכות סטציונריות. כלומר, איננו מתמודדים עם בעיות של הדבקה בלתי הפיכה של חומרים לפני השטח או איבוד דגימות במהלך התהליך. במקום זאת, כל ההפרדה מתרחשת באופן טבעי, בהתבסס אך ורק על הדרך שבה תרכובות שונות מתפלגות בין הנוזלים. התוצאה? אנו מסוגלים להבחין בין מולקולות דומות מאוד, כגון טקסנים או צורות שונות של פלבונואידים, שכולן היו קשות להבחנה ללא שיטה זו. כרומטוגרפיה נגדית (CCC) מצליחה בדרך כלל להשיג כ־3000 צלחות תיאורטיות, הרבה יותר מאשר הכרומטוגרפיה הפסיבית עתירת הלחץ (HPLC) הסטנדרטית, שברוב המקרים אינה עוברת את 500 הצלחות. למה זה כל כך חשוב? משום שכאשר הפאזות מתחדשות באופן מתמיד ופיזור הרצועות החומריות מופחת, אנו מקבלים צמיגות חדה בהרבה וחלקים טהורים יותר. ועבור חוקרים שמנסים לבודד רכיבים פעילים מתערובות מורכבות, דיוק מסוג זה פשוט לא ניתן להביס.
שיטה של כרומטוגרפיה נגד זרימה מהירה (HSCCC) מציגה יתרונות ברורים בהפרדת פאקליטקסל, תרכيب נוגד סרטן לא יציב שדורש הפרדה זהירה. מחקרים מראים שאפשר לשחזר כ-98% מהפאקליטקסל הלא פגום באמצעות שיטות HSCCC, מה שמעל על שיטות HPLC סטנדרטיות שמשיגות רק כ-82–85%, מאחר שהתרכיבים נוטים להתחבר ולהתפרק על עמודות סיליקה. ביחס להפרדת פאקליטקסל ממשימות דומות כגון באקאטין III ו-10-דיאצטילבאקאטין III, שיטת HSCCC משיגה רזולוציה טובה יותר בפקטור של כ-1.5. תופעה זו נובעת בעיקר מכך ש-HSCCC פועלת בפазת התמיסה ולא מסתמכת על אינטראקציות עם השטח. יתרון נוסף משמעותי הוא שמצריכת פחות ב-60% מסולבנטים בהשוואה לתהליכי HPLC המסורתיים, מה שהופך את כל התהליך ליותר יעיל מבחינה עלות-תועלת. עבור מעבדות העוסקות במוצרים טבעיים עדינים, שבהם שימור המבנה הכימי של החומר הוא קריטי ביותר, תוצאות אלו מדגישות בבהירות מדוע HSCCC נחשבת לבחירה המועדפת.
כרומטוגרפיה בזרימה נגדית שומרת על מולקולות ביולוגיות שלמות מכיוון שהיא מאפילה לחלוטין על ממשקים אלו של פאזה מוצקה. ממשקים אלו הם בדרך כלל הסיבה לבעיות כגון דנטורציה, אגרגציה, וכשמולקולות נתקעות ונשחפות. שיטות מסורתיות מסתמכות על חומרים כמו סיליקה או רזינים פולימריים שכוללים מקומות הידרופוביים שגורמים לחץ על צורת המולקולות. לעומת זאת, בחלוקה נוזל-נוזל, חלבונים, נוגדנים ופטידים נשארים בפתרון לאורך כל התהליך. לפי מחקר שפורסם בכתב העת Nature בשנה שעברה, גישה זו מונעת את תופעת הפתיחה הלא הפיכה שמתרחשת בכ־38% מהחלבונים הטיפוליים בשימוש בשיטות פאזה מוצקה. שיעורי ההחזרה עולים ב־25% עד 40%, וחשוב לציין שהאנזימים ממשיכים לפעול כראוי והנוגדנים שומרים על יכולתם לקשור אנטיגנים. מה שנותן לטכניקה זו ערך רב הוא שאין בה שימוש בלחץ גבוה, אין חומרים קשיחים עם קבצים שעלולים לסתום, ואין בכלל כוחות גזירה שפורצים את המולקולות. עובדה זו חשובה במיוחד עבור חומרים ביולוגיים רגישים כגון נוגדנים חד-מונוקלוניים והרבה הורמונים פטידיים שלא מתמודדים היטב עם טיפול גס.
| שיטה להפרדה | סיכון לדנטורציה | אובדן דרך ספיגה | השלמות המבנית |
|---|---|---|---|
| פאזה מוצקה | גבוה | 15–30% | הושפע |
| זרימה נגדית | זניח | <5% | נשמר |
היציבות חשובה מאוד בעת עיבוד מולקולות ביולוגיות רגישות לחום. אפילו מגע קצר בטווח הטמפרטורות של כ-45 מעלות צלזיוס עלול לגרום לבעיות חמורות, כגון אגירת לא הפיכה בתהליכי עמודים, כפי שפורסם מחקר בכתב העת Journal of Bioprocessing בשנה שעברה. לכן טכנולוגיית ה-CCC יוצאת דופן, מאחר שהיא פועלת בתנאי לחץ וטמפרטורה סביבתיים רגילים. בזכות היתרונות הללו, מעבדות רבות החלו לעבור לשיטות זרימה נגדית לצורך טיהור אנטיגנים חיסונים ויישומים מגוונים ברפואה רגנרטיבית. מה שחשוב באמת כאן אינו רק כמות החומר המוחזר, אלא האם המולקולות נותרות תפקודיות לאחר העיבוד — עובדה שמגדירה אם כל התהליך הצליח או לא.
כרומטוגרפיית זרימה נגדית מפחיתה את כמות הממסים האורגניים הנדרשים ב-70% בערך בהשוואה לשיטות HPLC הכנות המסורתיות. זה אומר חיסכון ממשי בכסף לא רק ברכישת הממסים, אלא גם בכל העבודה הנוספת הכרוכה בהפעלתם ובהתמודדות עם פסולת מסוכנת. הפחתה בשימוש בממסים מובילה להפחתת מה שמכנים הכימאים 'גורם סביבתי' (E Factor) לערך של כ-24 בתהליכי כרומטוגרפיית זרימה נגדית (CCC). זהו ערך נמוך בהרבה לעומת הטווח הרגיל של 25–100 הנראה בשיטות HPLC הכנות הסטנדרטיות. השימוש בממסים מופחת מעורר יתרונות נוספים: הוא מאיץ את תהליך הרציה, מפחית את העומס על מערכות הציוד, ומשפר באופן כללי את תהליכי הניקוי, על ידי הסרת מחסומים מטרידים שמעכבים את ההתקדמות. קחו לדוגמה את הפקת צמחים בקנה מידה תעשייתי: מה שדורש בדרך כלל 10 ליטרים של ממס בשיטת HPLC הכנה, ניתן לבצע בעזרת 3 ליטרים בלבד באמצעות כרומטוגרפיית זרימה נגדית – לפי מבחנים אחרונים שפורסמו ב-Journal of Chromatography Comparative Analysis. כל השיפורים הללו משמעם שכירומטוגרפיית זרימה נגדית מתאימה היטב לפעולות בקנה מידה גדול, ללא עלות יתרה, תוך שמירה על ידידותיות לסביבה. ולבסוף, גישה מסוג זה עומדת בדרישות הרגולטורים המודרניות בנוגע לייצור ירוק בתחומי התרופה והמזון התזונתי.
מערכות זרימה נגדית מאפשרות הרחבה קלה מניסויים מעבדתיים קטנים (כגון דוגמאות בגודל 1 מ״ל או 10 מ״ל) ועד לריצות תעשייתיות גדולות (לפעמים עד 1,000 ליטר), כמעט ללא צורך בהתאמות חוזרות. הקסם מתבצע בזכות העובדה שמערכת זו מבוססת על תרמודינמיקת הפרדה בסיסית, ולא על גורמים כגון צורת העמודה, מידת הצפיפות של החומר בתוכה או קצב הזרימה המשפיע על העברת המסה. בפועל, זה אומר שחוקרים יכולים להשתמש באותם מסתנים ויחסים של זרימה, ללא תלות בגודל הציוד שעימם הם עובדים — קטן או עצום. רבות מהמעבדות מעבירות את שיטות העבודה שלהן ישירות ממערכת בגודל ליטר אחד למערכת בגודל 1,000 ליטר, מבלי לשנות כלל את יחסי הפאזות, מהירויות הסיבוב או פרופילי הגרדיאנט שעליהם כל כך מתמקדים. עקביות מסוג זה חוסכת לחברות כמחצית הזמן שבדרך כלל נדרש לאישור התהליכים, ומונעת סבבים יקרים של פיתוח מחדש. עבור יצרני תרופות ביולוגיות מורכבות, חיסונים ואפילו תרופות ממקור צמחי, היכולת להרחיב במהירות את הייצור משמעותה הגעה מהירה יותר של המוצרים לחולים, לצד הפחתת הסיכונים הנלווים להוצאתם לשוק. לכן, כרומטוגרפיה זרימה נגדית הפכה לכלי חשוב ביותר לכל מי שמתמקד בטכניקות מודרניות של ניקוי ביולוגי.
כרומטוגרפיה נגד זורם (CCC) היא תהליך הפרדה נוזל-נוזל ללא פאזה קבועה, אשר מונע בעיות כגון ספיגה לא הפיכה ואובדן דגימה שנצפו בשיטות התומכות במעשנים.
ה-CCC מגיעה עד 3000 לוחות תיאורטיים, ועוקפת את הממוצע של 500 הלוחות בהפלכ"א הסטנדרטית, מה שמביא לרזולוציה גבוהה יותר והפרדות טהורות יותר.
ה-CCC משתמשת עד 70% פחות מסולvents אורגניים בהשוואה להפלכ"א הכנתית, ובכך מפחיתה את עלויות הפעלה ואת ההשפעה הסביבתית על ידי צמצום גורם ה-E (E-Factor).
ה-CCC מונעת денטורה ואובדן דרך ספיגה על ידי הסרת התומכים המוצקים, ומשמרת בכך את האינטגריות של המולקולות הביולוגיות ומשפרת את שיעורי ההחזרה.
כן, ה-CCC ניתנת להרחבה מהדגימות הקטנות במעבדה ועד ל партиות תעשייתיות גדולות עם מינימום אופטימיזציה מחדש, מה שהופך אותה למתאימה במיוחד לייצור תרופות וויצ'נים.
EN
