Vastavirtajärjestelmät toimivat paremmin aineiden erottamisessa, koska ne käyttävät jatkuvaa nesteen ja nesteen välistä jakautumista, mikä luo useita tasapainovaiheita, jotka toimivat kuin teoreettisia levyjä. Erityispiirteeksi näille järjestelmille verrattuna perinteisiin kiinteän faasin menetelmiin on se, että niissä ei käytetä kiinteitä kantoja. Tämä tarkoittaa, ettei meillä ole ongelmia aineiden irrevokabilen kiinnittymisen tai näytteiden menetyksen kanssa prosessin aikana. Sen sijaan kaikki erotellaan luonnollisesti puhtaasti sen mukaan, kuinka eri yhdisteet jakautuvat nesteiden välillä. Tuloksena saadaan eroteltua hyvin samankaltaisia molekyylejä, kuten taksaaneja tai erilaisia flavonoidimuotoja, joita muuten olisi vaikea erottaa toisistaan. Vastavirtakromatografia eli CCC saavuttaa tyypillisesti noin 3000 teoreettista levyä, mikä on huomattavasti enemmän kuin standardin HPLC:n yleensä saavuttama maksimi noin 500 levyä. Miksi tämä on niin tärkeää? Koska kun faasit päivitetään jatkuvasti ja aineiden vyöhykkeiden hajaantuminen on vähäisempää, saadaan paljon terävämpiä piikkejä ja puhdempia fraktioita. Ja tutkijoille, jotka pyrkivät erottamaan vaikuttavia aineita monimutkaisista seoksista, tällainen tarkkuus on korvaamaton.
Korkean nopeuden vastavirtakromatografiamenetelmä (HSCCC) osoittaa selviä etuja paclitakselin puhdistamisessa, joka on epävakaa syöpää torjuva yhdiste ja joka vaatii huolellista erottelua. Tutkimusten mukaan noin 98 % ehjää paclitakselia voidaan saada talteen HSCCC-menetelmillä, mikä on parempaa kuin perinteiset HPLC-menetelmät, jotka saavuttavat vain noin 82–85 %:n talteenoton, koska yhdisteet tarttuvat ja hajoavat silikagelipylväisiin. Kun kyseessä on paclitakselin erotteleminen samankaltaisista aineista, kuten bakkatiinista III ja 10-deasetyylibakkatiinista III, HSCCC saavuttaa noin 1,5-kertaisen erotuskyvyn. Tämä johtuu pääasiassa siitä, että HSCCC toimii liuosfaasissa eikä perustu pinnallisiin vuorovaikutuksiin. Toinen merkittävä etu on, että liuotinkulutus vähenee noin 60 %:lla verrattuna perinteisiin HPLC-prosesseihin, mikä tekee koko operaatiosta huomattavasti kustannustehokkaamman. Laboratorioille, jotka työskentelevät herkillä luonnonaineilla ja joille rakenteen säilyttäminen on tärkeintä, nämä tulokset korostavat selvästi, miksi HSCCC erottautuu suosituimmaksi valinnaksi.
Vastavirtakromatografia säilyttää biomolekyylit ehjinä, koska se poistaa kiinteät faasirajapinnat täysin. Nämä rajapinnat aiheuttavat yleensä ongelmia, kuten denaturaatiota, aggregaatiota sekä molekyylien tarttumista ja menetystä. Perinteiset menetelmät perustuvat esimerkiksi piidioksidin tai polymeeriresinien käyttöön, joissa on näitä hydrofobisia kohtia, jotka itse asiassa rasittavat molekyylien rakennetta. Nestefaasin välinen jakautuminen sen sijaan pitää proteiinit, vasta-aineet ja peptidit liuoksessa koko prosessin ajan. Viime vuonna Nature-lehdessä julkaistun tutkimuksen mukaan tämä menetelmä estää irrevokaalin rakenneavautumisen, joka tapahtuu noin 38 %:lla terapeuttisista proteiineista kiinteän faasin menetelmiä käytettäessä. Erotusasteet nousevat 25–40 prosenttiyksikköä, ja mikä tärkeintä, entsyymit säilyttävät toimintakykynsä ja vasta-aineet säilyttävät kykynsä sitoa antigeenejä. Tämän tekniikan erityisarvo johtuu siitä, että siihen ei liity korkeaa painetta, ei tukkoisia poroosia materiaaleja eikä varsinaisia leikkausvoimia, jotka hajoittaisivat rakenteita. Tämä on erityisen tärkeää herkille biologisille tuotteille, kuten monoklonaalisille vasta-aineille ja erilaisille peptidihormonille, jotka eivät kestä lainkaan kovaa käsittelyä.
| Erotusmenetelmä | Denaturaation riski | Adsorptiivinen menetys | Rakenteellinen eheys |
|---|---|---|---|
| Kiinteä vaihe | Korkea | 15–30% | Kompromisoitu |
| Vastavirtamenetelmä | Merkitsevästi vähäinen | <5% | Suojattu |
Stabiilius on erityisen tärkeää lämpöherkkiä biomolekyylejä käsiteltäessä. Tutkimuksen mukaan, joka julkaistiin viime vuonna Journal of Bioprocessing -lehdessä, jo lyhyt kosketus noin 45 asteen lämpötilaan voi aiheuttaa vakavia ongelmia, kuten irrotettavaa aggregaatiota sarjakäsittelemismenettelöissä. Siksi CCC-teknologia erottautuu, sillä se toimii normaalissa huonepaineessa ja huonelämpötilassa. Näiden etujen vuoksi monet laboratoriot ovat siirtyneet käyttämään vastavirtamenetelmiä esimerkiksi rokote-antigeenien puhdistamiseen ja erilaisiin regeneratiivisen lääketieteen sovelluksiin. Tässä ratkaisevaa ei ole pelkästään se, kuinka paljon materiaalia saadaan talteen, vaan myös se, säilyttävätkö molekyylit toimintakykynsä käsittelyn jälkeen – mikä määrittelee koko operaation onnistumisen tai epäonnistumisen.
Vastavirtakromatografia vähentää tarvittavia orgaanisia liuottimia noin 70 % verrattuna perinteisiin valmistavaan HPLC-menetelmään. Tämä tarkoittaa todellista säästöä ei ainoastaan liuottimien ostokustannuksissa, vaan myös kaikissa niiden käsittelyyn liittyvissä ylimääräisissä tehtävissä sekä vaarallisen jätteen käsittelyssä. Liuottimien käytön väheneminen laskee kemistien kutsuamaa ympäristötekijää eli E-tekijää noin 24:ksi CCC-prosesseissa. Tämä on huomattavasti parempi kuin tavallisesti valmistavassa HPLC:ssä havaittu 25–100:n alue. Liuottimien käytön vähentämisellä on muitakin etuja: analyysit suoritetaan nopeammin, laitteistoihin kohdistuva rasitus pienenee ja yleisesti ottaen poistuvat ne ärsyttävät puhdistusprosessien esteet, jotka hidastavat työnkulkuja. Otetaan esimerkiksi teollisuuden mittakaavan kasviuutteiden erottelu. Jotkin hiljattaiset tutkimukset, jotka julkaistiin Chromatography Journal -lehdessä (Comparative Analysis), osoittavat, että mikä normaalisti vaatii 10 litraa liuotinta valmistavassa HPLC:ssä, voidaan suorittaa vain 3 litralla liuotinta CCC:n avulla. Kaikki nämä parannukset tarkoittavat, että CCC toimii hyvin myös suuremmilla mittakaavoilla ilman liiallisia kustannuksia ja samalla pysyy ympäristöystävällisenä. Ja tottakai tämäntyyppinen lähestymistapa sopii täydellisesti nykypäivän sääntelyviranomaisten vaatimuksiin vihreästä valmistuksesta lääke- ja ravintolisäteollisuudessa.
Vastavirtajärjestelmät tekevät pienistä laboratoriotesteistä (kuten 1 mL tai 10 mL:n näytteistä) suoraan suuriin teollisiin tuotantokokoihin (jopa 1 000 litraan asti) tapahtuvan skaalauksen melko suoraviivaiseksi, ja lähes ei tarvita uudelleen säätöjä. Taikuus tapahtuu siitä, että menetelmä perustuu perusjakautumistermodynamiikkaan eikä sellaisiin tekijöihin kuin sarakkeen muoto, täyttötiukkuus tai virtausnopeuden vaikutus massansiirtoon. Käytännössä tämä tarkoittaa, että tutkijat voivat käyttää samoja liuottimia ja virtaussuhteita riippumatta siitä, ovatko he käyttämisessään pieniä vai suuria laitteita. Monet laboratoriot siirtävätkin menetelmänsä suoraan 1 litran järjestelmästä 1 000 litran järjestelmään muuttamatta mitään faasisuhteista, pyörintänopeuksista tai niistä gradienttiprofiileista, joiden suhteen kaikki niin hermostuvat. Tämä yhdenmukaisuus säästää yrityksiltä noin puolet ajasta, joka normaalisti kuluu prosessien validointiin, ja välttää kalliita uudelleenkehityskierroksia. Niille, jotka valmistavat monimutkaisia biologisia lääkkeitä, rokotteita tai jopa kasvipohjaisia lääkkeitä, tämä nopea skaalausmahdollisuus tarkoittaa potilaille saattamisen nopeuttamista sekä markkinoille tuomisen riskejä pienentävää toimintaa. Siksi vastavirtakromatografia onkin tullut erinomaisen tärkeäksi työkaluksi kaikille, jotka ottavat vakavasti nykyaikaiset biopuhdistustekniikat.
Vastavirtakromatografia (CCC) on nestenäisten faasien erotusmenetelmä, jossa ei käytetä kiinteää faasia, mikä estää ongelmia kuten irrevokaabelle adsorptiolle ja näytteen menetykselle, joita esiintyy kiinteän tukimateriaalin perusteisissa menetelmissä.
CCC saavuttaa jopa 3000 teoreettista levyä, ylittäen tavallisen HPLC:n keskimääräisen arvon 500 levyä, mikä johtaa korkeampaan erotustarkkuuteen ja puhtaampiin erotuksiin.
CCC käyttää jopa 70 % vähemmän orgaanisia liuottimia kuin valmistava HPLC, mikä alentaa toimintakustannuksia ja vähentää ympäristövaikutuksia pienentämällä E-tekijää.
CCC välttää denaturoitumisen ja adsorptiivisen menetyksen poistamalla kiinteät tukimateriaalit, säilyttää biomolekyylien eheytetä ja parantaa erottamisen saantoa.
Kyllä, CCC voidaan skaalata pienistä laboratorionäytteistä suuriin teollisiin eriin melko vähällä uudelleenoptimoinnilla, mikä tekee siitä ideaalin menetelmän lääkkeiden ja rokotteiden tuotannossa.
EN
