Kādas ir pretplūsmas sistēmas priekšrocības?

Augstāka separācijas efektivitāte pretplūsmas sistēmās

Kā dinamiska šķidruma–šķidruma sadalīšana ļauj sasniegt augstāku teorētisko plākšņu skaitu

Pretpusēju sistēmas darbojas efektīvāk vielu atdalīšanai, jo tās izmanto nepārtrauktu šķidruma–šķidruma sadalīšanu, kas rada vairākas līdzsvara pakāpes, kas darbojas kā teorētiskās plātnes. To, kas šīs sistēmas padara īpaši atšķirīgas salīdzinājumā ar tradicionālajām cietās fāzes metodēm, ir tas, ka tajās nav iesaistīti nekādi stacionāri nesēji. Tas nozīmē, ka mums nerodas problēmas ar vielu neatgriezenisku pielipšanu virsmām vai paraugu zudumu procesa laikā. Vietoj tam visa notiek dabiski, pamatojoties tikai uz to, kā dažādas savienojumu veidas sadalās starp šķidrumiem. Rezultāts? Mēs varam atšķirt pat ļoti līdzīgas molekulas, piemēram, taksanus vai dažādas flavonoīdu formas, ko citādi būtu grūti atšķirt. Pretplūsmas hromatogrāfija (CCC) parasti sasniedz aptuveni 3000 teorētiskās plātnes — daudz vairāk nekā standarta HPLC, kas lielākoties ierobežojas ar maksimāli aptuveni 500 plātnēm. Kāpēc tas ir tik svarīgi? Jo, kad fāzes tiek nepārtraukti atsvaidzinātas un vielu joslu izplatīšanās ir mazāka, mēs iegūstam daudz asākas virsotnes un tīrākas frakcijas. Un pētniekiem, kuri cenšas izolēt aktīvās vielas no sarežģītām maisījumu sistēmām, šāda precizitāte vienkārši nav apsteigama.

Gadījuma pierādījumi: Paclitaksela attīrīšana ar augstsākuma centriskās plūsmas hromatogrāfiju (CCC) pārspēj HPLC atdalīšanas un atgūšanas jomā

Augstas ātruma pretplūsmas hromatogrāfijas (HSCCC) metode rāda skaidras priekšrocības, purificējot paclitakselu — nestabilu pretvēža savienojumu, kuram nepieciešama rūpīga izolācija. Pētījumi liecina, ka ar HSCCC tehnikām var iegūt aptuveni 98 % nesabojāta paclitaksela, kas pārsniedz standarta HPLC metožu rezultātus (aptuveni 82–85 %), jo šie savienojumi tendē pielipt pie silīkola kolonnām un tur sadalīties. Attiecībā uz paclitaksela atdalīšanu no līdzīgiem savienojumiem, piemēram, bakatīna III un 10-deacetilbakatīna III, HSCCC nodrošina aptuveni 1,5 reizes labāku izšķirtspēju. Tas galvenokārt notiek tāpēc, ka HSCCC darbojas šķīduma fāzē, nevis balstās uz virsmas mijiedarbībām. Vēl viena liela priekšrocība ir toksisko šķīdinātāju patēriņa samazināšana par aptuveni 60 % salīdzinājumā ar tradicionālajām HPLC procedūrām, kas padara visu procesu daudz ekonomiskāku. Laboratorijām, kur strādā ar delikātiem dabas produktiem un kur galvenais mērķis ir saglabāt molekulāro struktūru nesabojātu, šie rezultāti patiesi izceļ HSCCC kā vēlamāko izvēli.

Biomolekulāru struktūru saglabāšana bez cietiem nesējiem

Kāpēc bez nesējiem veikta pretplūsmas sadalīšana novērš denaturāciju un adsorbcijas zudumus

Pretpusējās plūsmas hromatogrāfija saglabā biomolekulas neskarītas, jo tā pilnībā novērš šos cietās fāzes interfeisus. Tie ir tie, kas parasti izraisa problēmas, piemēram, denaturāciju, agregāciju un molekulu pieķeršanos un zudumu. Tradicionālās metodes balstās uz materiāliem, piemēram, silīciju vai polimēru režus, kuros ir šādas hidrofobās vietas, kas patiesībā izraisa molekulu struktūras stresu. Tomēr ar šķidruma–šķidruma sadalīšanu olbaltumvielas, antivielas un peptīdi visu procesa laikā paliek šķīdumā. Pētījuma rezultāti, kas pagājušajā gadā publicēti žurnālā «Nature», liecina, ka šī pieeja novērš neatgriezeniskās atvēršanās problēmu, kas rodas aptuveni 38 % terapeitiskajām olbaltumvielām, izmantojot cietās fāzes metodes. Atgūšanas rādītāji palielinās par 25–40 %, un, svarīgi, enzīmi joprojām pareizi darbojas, bet antivielas saglabā savu spēju saistīt antigēnus. Šīs tehnoloģijas lielākā vērtība ir tāda, ka tai nepieciešams tikai zems spiediens, nav porainu materiālu, kas var aizsprostoties, un noteikti nav šķērsvirzienu spēku, kas var sabojāt molekulas. Tas ir ļoti būtiski jutīgiem bioloģiskiem produktiem, piemēram, monoklonālajām antivielām un dažādajiem peptīdu hormoniem, kuri vispār nespēj izturēt rupju apstrādi.

Stabilitāte ir ļoti svarīga, strādājot ar siltumjūtīgām biomolekulām. Pētījumi, kas publicēti pagājušajā gadā žurnālā «Journal of Bioprocessing», liecina, ka pat īslaicīgs kontaktēšanās ar aptuveni 45 °C temperatūru var izraisīt nopietnas problēmas, piemēram, neatgriezenisku agregāciju kolonnas procesos. Tāpēc CCC tehnoloģija izceļas — tā darbojas normālos istabas spiediena un temperatūras apstākļos. Šo priekšrocību dēļ daudzas laboratorijas jau ir sākušas pāriet uz pretpusējošajām metodēm, piemēram, vakcīnu antigēnu attīrīšanai un dažādām regeneratīvās medicīnas lietojumprogrammām. Galvenais šeit nav tikai tas, cik daudz materiāla tiek atgūts, bet vai molekulas pēc apstrādes saglabā savu funkcionālumu — tas nosaka, vai visu procesu var uzskatīt par veiksmīgu vai nē.

Samazinātas ekspluatācijas izmaksas un šķīdinātāju patēriņš

organisko šķīdinātāju izmantošana par 70 % zemāka nekā preparatīvajā HPLC — ietekme uz E-faktoru un zaļo ražošanu

Pretrēzējās plūsmas hromatogrāfija samazina organisko šķīdinātāju patēriņu aptuveni par 70 % salīdzinājumā ar tradicionālajām preparatīvās HPLC metodēm. Tas nozīmē reālu naudas ietaupījumu ne tikai šķīdinātāju iegādei, bet arī visai papildu darbībām, kas saistītas ar to apstrādi, kā arī bīstamo atkritumu apstrādei. Šķīdinātāju patēriņa samazināšanās pazemina ķīmiķu saukto vides faktoru vai E faktoru līdz aptuveni 24 CCC procesiem. Tas ir daudz labāk nekā parastais diapazons no 25 līdz 100, ko redz ar standarta preparatīvajām HPLC metodēm. Mazāks šķīdinātāju patēriņš piedāvā arī citus priekšrocības: analīzes notiek ātrāk, mazāk slodzes tiek uzlikta aprīkojuma sistēmām un vispārēji tiek novērstas tās nepatīkamās attīrīšanas grūtības, kas palēnina darba gaitu. Piemēram, rūpnieciskā mērogā veicot augu izgūšanu, kas parasti prasa 10 litrus šķīdinātāja ar preparatīvo HPLC, pēc nesenām testēšanas rezultātiem žurnālā «Journal of Chromatography Comparative Analysis» CCC izmantojot pietiek tikai 3 litrus šķīdinātāja. Visas šīs uzlabošanas nozīmē, ka CCC efektīvi darbojas lielākos mērogos, neatkarīgi no izmaksām, vienlaikus saglabājot videi draudzīgu pieeju. Un godīgi sakot, šāda pieeja pilnībā atbilst tam, ko regulējošās iestādes šodien prasa zaļās ražošanas praksē farmācijas un uzturvielu nozarēs.

Mērogojama biopurifikācija ar minimālu metodes pārveidošanu

Pretpusēju sistēmas padara ļoti vienkāršu mērogošanu no nelieliem laboratorijas testiem (piemēram, 1 mL vai 10 mL paraugiem) līdz lieliem rūpnieciskiem procesiem (dažreiz pat līdz 1000 litriem), gandrīz nevajadzīgo papildu pielāgojumu veikšanu. Šīs sistēmas darbības pamatā ir vienkārša sadalīšanas termodinamika, nevis tādi faktori kā kolonnas forma, iepakojuma blīvums vai plūsmas ātrumi, kas ietekmē masas pārnesi. Praksē tas nozīmē, ka pētnieki var izmantot vienus un tos pašus šķīdinātājus un plūsmas attiecības neatkarīgi no tā, vai tie strādā ar ļoti maziem vai ļoti lieliem aprīkojuma izmēriem. Daudzas laboratorijas pat pārnes savas metodes tieši no 1 litra iekārtas uz 1000 litru iekārtu, nemainot ne fāžu attiecības, ne rotācijas ātrumus, ne arī tās gradienta profila parametrus, par kuriem visi tik daudz satraucas. Šāda vienveidība uzņēmumiem saglabā aptuveni pusi no laika, ko parasti patērē procesu validācijai, un novērš dārgas atkārtotas izstrādes kārtnes. Cilvēkiem, kas ražo sarežģītus bioloģiskos zālīšus, vakcīnas vai pat augu izcelsmes zāles, šī ātrā mērogošanas iespēja nozīmē ātrāku produktu piegādi pacientiem un riska samazināšanu to tirgū izvedīšanas laikā. Tāpēc pretpusēju hromatogrāfija ir kļuvusi par ļoti svarīgu rīku visiem, kas nopietni pievēršas modernām biopurifikācijas metodēm.