Modstrømsystemer fungerer bedre ved separation af stoffer, fordi de bruger kontinuerlig væske-til-væske-partitionering, hvilket skaber flere ligevægtsstadier, der virker som teoretiske plader. Det, der gør disse systemer særlige i forhold til traditionelle fastfasemetoder, er, at der ikke indgår nogen stationære bærematerialer. Dette betyder, at vi undgår problemer med, at stoffer fastholder sig uigenkaldeligt til overflader, eller med tab af prøver under processen. I stedet sker separationen naturligt udelukkende på baggrund af, hvordan forskellige forbindelser fordeler sig mellem væskerne. Resultatet? Vi kan skelne mellem meget ensartede molekyler, såsom taxaner eller forskellige flavonoidformer, som ellers ville være svære at adskille. Modstrømskromatografi (CCC) opnår typisk omkring 3000 teoretiske plader – langt mere end standard-HPLC normalt opnår, hvor maksimum ofte ligger på ca. 500 plader. Hvorfor er dette så afgørende? Fordi når faserne konstant fornyes og der sker mindre spredning af stofbåndene, opnår vi betydeligt skarpere toppe og renere fraktioner. Og for forskere, der forsøger at isolere aktive ingredienser fra komplekse blandinger, er denne type præcision simpelthen uslåelig.
Metoden High-Speed Countercurrent Chromatography (HSCCC) viser tydelige fordele ved rensning af paclitaxel, en ustabil anticancerforbindelse, der kræver omhyggelig isolation. Forskning viser, at ca. 98 % af intakt paclitaxel kan genfindes ved hjælp af HSCCC-teknikker, hvilket overgår standard-HPLC-metoder, der kun opnår ca. 82–85 %, fordi forbindelserne har tendens til at blive fastholdt og nedbrydes på kiselsøjler. Når det gælder adskillelse af paclitaxel fra lignende stoffer som baccatin III og 10-deacetylbaccatin III, opnår HSCCC ca. 1,5 gange bedre opløsning. Dette skyldes hovedsageligt, at HSCCC foregår i løsningsfase i stedet for at bygge på overfladeinteraktioner. En anden stor fordel er, at opløsningsmiddelforbruget falder med ca. 60 % i forhold til traditionelle HPLC-processer, hvilket gør hele processen langt mere omkostningseffektiv. For laboratorier, der arbejder med følsomme naturlige produkter, hvor det er afgørende at bevare strukturen intakt, understreger disse resultater virkelig, hvorfor HSCCC fremstår som den foretrukne metode.
Modstrømskromatografi bevarer biomolekyler intakte, fordi den helt undgår fastfasegrænsefladerne. Disse grænseflader er typisk årsag til problemer som denaturering, aggregering samt tilfælde, hvor molekyler fastholder og går tabt. Traditionelle metoder bygger på materialer som silikagel eller polymerharpikser, der indeholder hydrofobe områder, som faktisk påvirker molekylernes form negativt. Med væske-væske-fordeling forbliver proteiner, antistoffer og peptider i opløsning gennem hele processen. Ifølge forskning offentliggjort i Nature sidste år forhindrer denne fremgangsmåde den irreversible udfoldning, der opstår hos ca. 38 % af terapeutiske proteiner ved brug af fastfasemetoder. Genindvindingsprocenterne stiger med 25–40 %, og vigtigere er, at enzymer stadig fungerer korrekt, mens antistoffer bibeholder deres evne til at binde antigener. Denne tekniks store værdi ligger i, at der ikke anvendes højt tryk, der ikke er porøse materialer, der kan tilstoppes, og slet ikke skærfkræfter, der revner molekylerne itu. Dette er særligt betydningsfuldt for følsomme biologiske stoffer såsom monoklonale antistoffer og forskellige peptidhormoner, som overhovedet ikke tåler grov behandling.
| Adskillelsesmetode | Risiko for denaturering | Adsorptionsbetinget tab | Strukturel integritet |
|---|---|---|---|
| Fastfase | Høj | 15–30% | Kompromitteret |
| Modstrøms | Fornegligeligt | <5% | Bevaret |
Stabilitet er meget vigtig, når man arbejder med varmesensitive biomolekyler. Ifølge en undersøgelse, der blev offentliggjort i Journal of Bioprocessing sidste år, kan endda kortvarig kontakt med temperaturer omkring 45 grader Celsius forårsage alvorlige problemer som irreversibel agglomeration i kolonnebaserede processer. Derfor skiller CCC-teknologien sig ud, da den fungerer ved normale stuetemperatur- og trykforhold. På grund af disse fordele har mange laboratorier begyndt at skifte til modstrømsmetoder til bl.a. rensning af vaccineantigener og forskellige regenerativ medicinske anvendelser. Det afgørende her er ikke kun, hvor meget materiale der genoprettes, men om molekylerne bibeholder deres funktion efter behandlingen – hvilket afgør, om hele operationen er vellykket eller ej.
Modstrømskromatografi reducerer behovet for organiske opløsningsmidler med omkring 70 % i forhold til traditionelle præparative HPLC-metoder. Dette betyder reelle besparelser – ikke kun på køb af opløsningsmidler, men også på den ekstra arbejdsindsats forbundet med deres håndtering samt behandlingen af farligt affald. Den faldende opløsningsmiddelforbrug sænker det, kemikere kalder miljøfaktoren eller E-faktoren, til omkring 24 for CCC-processer. Det er langt bedre end det sædvanlige interval på 25–100, som ses ved almindelige præparative HPLC-teknikker. Brugen af mindre opløsningsmidler har også andre fordele: Den gør analyser hurtigere, belaster udstyrsystemerne mindre og formindsker generelt de irriterende renholdingsproblemer, der sænker processen. Tag f.eks. botanisk ekstraktion i industrielt målestok som eksempel: Hvad normalt ville kræve 10 liter opløsningsmiddel med præparativ HPLC, kan ifølge nogle nyere tests i Journal of Chromatography Comparative Analysis udføres med blot 3 liter ved hjælp af CCC. Alle disse forbedringer betyder, at CCC fungerer effektivt i større skala uden at blive for dyr, samtidig med at metoden er miljøvenlig. Og lad os være ærlige: Denne type tilgang passer perfekt til de krav, myndighederne i dag stiller til grøn fremstilling inden for både farmaceutisk og nutraceutisk industri.
Modstrømsystemer gør det ret enkelt at skala op fra små laboratorietests (f.eks. prøver på 1 mL eller 10 mL) til store industrielle kørsler (nogle gange op til 1.000 liter), med næsten ingen behov for justering af parametrene. Magien ligger i, at metoden bygger på grundlæggende partitionstermodynamik i stedet for faktorer som kolonneform, pakketæthed eller strømningshastigheder, der påvirker masseoverførslen. I praksis betyder dette, at forskere kan anvende de samme opløsningsmidler og strømningsforhold uanset om de arbejder med meget små eller meget store anlæg. Mange laboratorier overfører faktisk deres metoder direkte fra et 1-liters-anlæg til et 1.000-liters-anlæg uden at ændre noget ved faseforholdene, rotationshastighederne eller de gradientprofiler, som alle bliver så optagede af. Denne type konsistens sparer virksomhederne omkring halvdelen af den tid, de normalt bruger på procesvalidering, og undgår dyre runder af nyudvikling. For dem, der fremstiller komplekse biologiske lægemidler, vacciner eller endda plantebaserede lægemidler, betyder denne hurtige skalering, at produkterne nås frem til patienterne hurtigere, mens risiciene ved markedsføringen reduceres. Derfor er modstrømskromatografi blevet et så vigtigt værktøj for enhver, der tager moderne biopurifikationsteknikker alvorligt.
Modstrømskromatografi (CCC) er en væske-væske-separationsproces uden fast fase, hvilket undgår problemer som irreversibel adsorption og prøveforlis, som ses ved metoder med fast bærer.
CCC opnår op til 3000 teoretiske plader, hvilket overgår den gennemsnitlige værdi på 500 plader for standard HPLC og resulterer i højere opløsning og renere separationer.
CCC bruger op til 70 % mindre organiske opløsningsmidler end præparativ HPLC, hvilket sænker driftsomkostningerne og den miljømæssige belastning ved at reducere E-faktoren.
CCC undgår denaturering og adsorptionsbetinget tab ved at fjerne faste bærere, hvilket bevarer biomolekylær integritet og forbedrer udbyttet.
Ja, CCC kan skaleres fra små laboratorieprøver til store industrielle batche med minimal genoptimering, hvilket gør den ideel til fremstilling af lægemidler og vacciner.
EN
